实验12质粒dna的提取.pptx

实验七 质粒DNA的提取 (碱法); 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 ;实验目的;实验原理;结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等;在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA之间交联形成不溶性结构，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。;实验仪器、材料与试剂 ;（二） 材料 ;（三） 试剂 ;2. SolutionⅠ 　50 mmol/L 葡萄糖 　 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0) 　 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 3. SolutionⅡ(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH 　 1% SDS ;4. Solution Ⅲ（100 ml） 5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 （pH 4.8）。 5. 氨苄青霉素（Amp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。 ;6. 胰RNA酶 将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 7. 氯仿，乙醇 ，70%乙醇。 8.TE缓冲液 10mM Tris.HCl (pH7.4) 1mM EDTA (pH8.0);实验步骤 ;6. 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新EP管中，注意所取体积。 7. 加入2倍体积无水冰乙醇混匀（注意动作轻），-20℃沉淀 10min。 8. 12,000 rpm离心3 min，弃上清，加入1ml 70%乙醇振荡漂洗一次，再10000 rpm离心2min，去上清。 9.沉淀于-20℃保存备用。;Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用） ? 操作过程 1. 将1～1.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中。 2. 于10，000rpm离心30 秒，并弃去上清液。 如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。 3. 加250μl Resuspension Buffer，重悬细菌体沉淀。 重悬后应该没有细菌团块。;4. 加250μl 细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒4～6 次。 不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。 5. 加350μl Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管4～6 次。 溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。 6. 于13,000rpm离心10 分钟。 如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。 7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体。 ;8. 向Spin column 内加650μl Wash Buffer，于12，000g 离心30～60 秒，并弃去接液管内液体。 9. 重复第8 步一次。 10. 再次于12，000rpm 离心1 分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。 11. 向Spin column 内加20μl Elution Buffer、去离子水或TE 溶液，并于室温静置1 分钟。 可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。 ;12. 于12，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内溶液中含有质粒DNA。 13. 提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。 ;实验结果及讨论