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生物化学实验:第三次实验.doc

发布:2020-10-29约2.23千字共3页下载文档
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实验三 福林(Folin)—酚试剂发测定蛋白质浓度 一.实验目的 熟悉并掌握Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法 二.实验原理 蛋白质(或多肽)分子中含有酪氨酸或色氨酸,能与Folin-酚试剂起氧化还原反应,生成蓝色化合物,蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比,可用比色法测定蛋白质浓度。 此法也适用于酪氨酸或色氨酸的定量测定。 三.实验仪器 蛋白质及其水解产物 722型(或7220型)分光光度计 试管1.5cm×15cm(×8) 吸管0.50ml(×4)、0.10ml(×2)、0.20ml(×2)、5.0ml(×1)。 四.实验试剂 1、Folin-酚试剂A:1g Na2CO3溶于50ml 0.1mol/L NaOH溶液。另将0.5g CuSO4·5H2O溶于100ml 1%酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液。将前者50ml于硫酸铜-酒石酸钾溶液1ml 混合。混合后的溶液一日内有效。 2、Folin-酚试剂B:将100g 钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g 钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、700ml蒸馏水、50ml 85%磷酸及100ml 浓盐酸置于1500ml 磨口圆底烧瓶中,充分混匀后,接上磨口冷凝管,回流10h。再加入硫酸锂150g,蒸馏水50ml 及液溴数滴,开口煮沸15min,驱除过量的溴(在通风橱内进行)。冷却,稀释至1000ml,过滤,滤液呈微绿色,贮于棕色瓶中。临用钱,用标准氢氧化钾溶液滴定,用酚酞做指示剂(由于试剂微绿,影响滴定终点的观察,可将试剂稀释1000倍再滴定)。根据滴定结果,将试剂稀释至相当于1mol/L的酸(稀释1倍左右),贮于冰箱中可长期使用。 3、卵清蛋白溶液:将含1mol/L的卵清蛋白溶液准确稀释至500μg/ml。 五.实验步骤 1、标准曲线的绘制 将7支干净试管编号,按表13顺序加入试剂 混匀,室温放置10min,各管再加Folin-酚试剂B 0.5ml,30min后比色(500nm),做吸光度-蛋白质浓度曲线。 Folin-酚法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制 管号试剂 0 1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白/ml 0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水/ml 0.5 0.45 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Folin-酚试剂/ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 浓度μg/ml 0 5.56 11.11 22.22 33.33 44.44 55.55 2、样液测定 准确吸取样液0.5ml 置干净试管内,加入4ml Folin-酚试剂A,10min后,再加试剂B 0.5ml,30min后比色(500nm),对照标准曲线求出样液蛋白质浓度。 六.实验结果的计算 Folin-酚试剂测牛血清蛋白质的吸光度 管号测量次数 0 1 2 3 4 5 6 样液 1 0.000 0.123 0.355 0.389 0.614 0.766 0.810 0.474 2 0.000 0.125 0.355 0.390 0.614 0.766 0.813 0.473 3 0.000 0.125 0.355 0.391 0.614 0.766 0.814 0.474 平均值 0.000 0.124 0.355 0.390 0.614 0.766 0.812 0.474 吸光度-蛋白质浓度曲线 样液的蛋白质浓度= [﹙0.474﹣0.0226﹚÷0.1544﹣1 ] ×11.11=21.371μg/ml 七.实验注意事项及思考题 注意事项: 在实验时,不要将牛血清蛋白和样液加反了; 一定要注意实验的时间,因为溶液的光密度值是随着时间在不断增大的,如果时间超过了30分钟,则测得的光密度值就不准确了; 由于分光光度计比较精密,所以往试管中加药品的时候要尽量做到准确; 在使用分光光度计时,那比色皿是要拿它的毛面,不可以用手接触它的光滑面,防止自己手上的油污是测量值不准确; 在擦拭比色皿时,要顺着一个方向擦; 在比色皿中装入的液体量大约要是比色皿体积的三分之二 比较蛋白质测定的几种方法 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 灵敏度低,适用于0.2~ 1.0mg氮,误差为±2% 费时8~10小时 将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定 非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离) 用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长 双缩脲法 灵敏度低1~20mg 中速20~30分钟 多肽键+碱性Cu2+?紫色络合物 硫酸铵;Tris缓冲液;某些氨基酸 用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50~100mg 快速5~10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶;各种核苷酸 用于层析柱流出液
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