蛋白质测定SOP.doc

蛋白质含量的测定? 1 范围 本文件适用于使用分光光度计对食品中蛋白质进行测定 2 原理? 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 3?试剂和材料? 除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T?6682规定的三级水。? 3.1?硫酸铜（CuSO4·5H2O）。?10.2?硫酸钾（K2SO4）。? 3.3?硫酸（H2SO4密度为1.84?g/L）：优级纯。 3.4?氢氧化钠（NaOH）。? 3.5?对硝基苯酚（C6H5NO3）。? 3.6?乙酸钠（CH3COONa·3H2O）。? 3.7?无水乙酸钠（CH3COONa）。? 3.8?乙酸（CH3COOH）：优级纯。? 3.9?37% 甲醛（HCHO）。 3.10 乙酰丙酮（C5H8O2）。? 3.11 氢氧化钠溶液（300 g/L）：称取30 g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100 mL。 3.12 对硝基苯酚指示剂溶液（1 g/L）：称取0.1 g对硝基苯酚指示剂溶于20 mL 95%乙醇中，加水稀释至100 mL。 3.13 乙酸溶液（1 mol/L）：量取5.8 mL乙酸（3.8），加水稀释至100 mL。? 3.14 乙酸钠溶液（1 mol/L）：称取41 g无水乙酸钠（3.7）或68 g乙酸钠（3.6），加水溶解后并稀释至500 mL。? 3.15 乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60 mL乙酸钠溶液（3.14）与40 mL乙酸溶液（3.13）混合，该溶液pH 4.8。? 3.16 显色剂：15 mL 甲醛（3.9）与7.8?mL乙酰丙酮（3.10）混合，加水稀释至100 mL，剧烈振摇混匀（室温下放置稳定3d）。? 3.17 氨氮标准储备溶液（以氮计）（1.0 g/L）：称取105 ℃干燥2 h的硫酸铵0.4720 g加水溶解后移于100 mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0 mg氮。? 3.18 氨氮标准使用溶液（0.1 g/L）：用移液管吸取10.00 mL氨氮标准储备液（3.17）于100 mL 容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于0.1mg氮。? 4?仪器和设备? 4.1 分光光度计。? 4.2 电热恒温水浴锅：100 ℃ ± 0.5 ℃。? 4.3 10 mL具塞玻璃比色管。? 4.4 天平：感量为1 mg。? 5 分析步骤? 5.1 试样消解 称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1 g～0.5 g（精确至0.001 g）、半固体试样0.2 g～1 g（精确至0.001 g）或液体试样1 g～5 g（精确至0.001 g），移入干燥的100 mL或250 mL定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g硫酸钾及5 mL硫酸（3.3），摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20 mL水，放冷后移入50 mL或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。? 5.2 试样溶液的制备? 吸取2.00 mL～5.00 mL试样或试剂空白消化液于50 mL或100 mL容量瓶内，加1滴～2滴对硝基苯酚指示剂溶液（3.12），摇匀后滴加氢氧化钠溶液（3.11）中和至黄色，再滴加乙酸溶液（3.13）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。? 5.3 标准曲线的绘制? 吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL和1.00 mL氨氮标准使用溶液（相当于0.00 μg、5.00 μg、10.0 μg、20.0 μg、40.0 μg、60.0 μg、80.0 μg和100.0 μg氮），分别置于10 mL比色管中。加4.0 mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（3.15）及4.0 mL显色剂（3.16），加水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。? 5.4 试样测定? 吸取0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮＜100 μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 mL比色管中。以下按5.3自“加4 mL乙酸钠-乙酸缓酸溶液（pH 4.8）及4 mL显色