凝胶过滤层析分离纯化纤维素酶的研究.doc

凝胶过滤层析分离纯化纤维素酶的研究 中图分类号:Q814. 1文献标识码:A文章编号: 1008 2816( 2003) 06 X088 }3 随着各种蛋自质纯化技术的出现，纤维素酶的分离纯 化研究也取得了很人进展，纤维毒酶已)’一泛应川于食品、医 药、饲料和纺织等领域。纤维素酶来源)’一泛、组分复杂，各 组分的分子量和等电点相差很小，分离纯化}_作比较困难 而纤维素酶的分纯}_作非常重要，只有得到纯酶，才能了解 其组成、性质及相4_关系，并可根据纤维素酶的小同理化性 质纤维材料的作川特点，开展纤维素降解机制的研究，为纤 维素酶分子结构}) I一究、酶基因克隆、新酶分子的构建和 DNA体外定点诱变等提供依据。 通常，纤维素酶的分离纯化多采川离子交换层析。山 于酶蛋自分子表而电荷的小均一性}‘]，刘一离子交换剂表现 了小同的亲和力，目_离子交换剂与酶蛋自分子之间的亲和 力小仅取决于酶分子表而携带电荷数日多寡，而目_与其分 子内电荷排布有关;而在离子交换层析，}，，只有分布在蛋自 质分子亲水表而的电荷才发挥作川，而存在于分子疏水核 心，}，的电荷在离子交换，I}小起作川。因而，一个简单的洗 脱条件很难将多种酶蛋自分离开来，往往需要复杂的洗脱 条件才能得到纯酶 0 凝胶过滤层析是根据样品}p各种物质分子量的小同， 通过多孔凝胶床达到分离的目的I 2l。这种方法条件温和 简便、分离范困)’一、回收率高，刘一牛化物质的分离十分适宜 我们利川葡萄糖凝胶层析技术刘一海洋适冷菌DZB1所 产纤维素酶进行了分离纯化。山于冷活性纤维素酶刘一热敏 感，故纯化}_作于4℃下进行。 1材料和方法 1. 1材料 1. 1. 1粗酶液 取DIB1菌种发酵液I?]于4 0C, 8000rpm,离心15分钟，收 集上清液即为粗酶液。 1. 1.2纤维素酶分离纯化材料与介质 透析超滤材料:lo, oooNM}VI透析袋，lo, oooNM}VL聚 醚飒超滤膜。 分离纯化介质:SPhh31PX;一lOO; Sephalex;一75; Sephadex(;一50; ( AMERSHAM PHARMACIA BI(rIECH公司) 1. 1.3卞要仪器 杯式超滤器( ArnicX)公司)，柱层析系统，DIY - 2稳几 稳流电泳仪(一1匕京六一仪}J ) ; DYY- m24D o电泳#} (-I} 京六一仪器));层析柱SOcan X 2. 6mm; 8823A紫外检测仪 (一1匕京新技术研究所);记录仪;分步收集器;高速冷冻离心 机;全温震荡培养箱。 1. 2方法 1. 2. 1纤维素酶活力测定方法}“] 1.2.2蛋自质含量测定 采川Folin-酚法}s]测定蛋自质含量，以牛血_清自蛋自 ( BSA)做标准曲线。 1.2.3纤维素酶的分离纯化方法 1.2.3.1粗酶液的制备:取发酵液于4 0C, 8000rpm,离心15 分钟，收集上清夜即为粗酶液。经测定，粗酶液，}，外切纤维 素酶活为1021ag/mL,蛋自质含量为14. 7rng/ rnl 0 1.2.3.2硫钱沉淀和透析:取粗酶液，加入硫酸钱至25 r`lc 饱和度，4 0C, 10000rpm,离心10分钟，分别测沉淀物和上清 液，}，的酶活,酶活集，}，于沉淀物，}，，收集沉淀物济于少量 0. OSmol/ L Ph6. 0磷酸缓冲液，}，，透析除盐，得到经硫酸钱 i} }淀的纯化酶液，此为分子筛柱层析上样样品。 1. 2. 3. 3 SDS- SPCE采川垂直板式小连续系统电泳，分 离胶浓度12%浓缩胶浓度4r`/c川0. 25 }/c(W/ Vl考马斯究 蓝R- 250酸性乙醇水染色。 1.2.3.4葡聚糖凝胶层析葡聚糖凝胶Sephadex G- 100, Sephadex G- 75和Sephadex G- 50，充分溶胀，抽气，分别装 柱(SOcm X 2. 6mm)，用O.OSmol/L pH6.0磷酸缓冲液充分平 衡后上样，上样量均为4. OmL，流速7mL/ h，检验器灵敏度为 0. 2A, 20分钟收集一管，(每管2. 4mL)，分别测定各管的 CM C酶活和微品纤维素酶活。以CM C酶活代表内切酶活， 微品纤维素酶活代表外切酶活。 2结果 取上述样品各4mL，分别上Sephadex G- 100, Sephadex G- 75和Sephadex G- 50凝胶层析柱，结果分别见图1、图 2、图3。 活和微品纤维素酶活得很高，没有得到纯酶。 (2)图2显示，样品经Sephadex G- 75柱层析分离后， 得到三个卞要的峰。分别称为峰I、峰II和峰