免疫学课件第22章免疫学检测技术的基本原理.ppt

免疫学检测技术的基本原理 抗原抗体反应的特点 高度特异性 抗原表位与抗体分子中超变区互补结合 表面化学基团之间的可逆结合 空间构象互补；通过氢键、静电引力、范德华力及疏水键等非共价的可逆结合。 适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原抗体反应的两个阶段 抗原抗体结合的特异性阶段。数秒钟至几分钟。 可见反应阶段。数分钟至数日。 抗原抗体反应的特异性 亲和力affinity：抗体分子上一个抗原结合部位与相应抗原决定基之间的结合强度。 亲合力avidity：一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。 非共价的可逆结合 抗原抗体反应的可见性 抗原抗体反应的影响因素 电解质 适当浓度的电解质会令沉淀反应更易出现，如0.85%NaCl。 温度 温度越高，出现可见反应的速度越快 37℃ pH 6~8之间 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 凝集反应 agglutination reactions 颗粒性抗原与相应抗体结合形成凝集团块 mg/ml 直接凝集 间接凝集 直接凝集-玻片凝集试验 正向间接凝集实验 反向间接凝集试验 Coombs test 沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀物 20mg/ml～2mg/ml 单向琼脂扩散 双向琼脂扩散 免疫电泳 免疫比浊 单向免疫扩散 含有一定浓度抗体的琼脂凝胶。 沉淀环直径与抗原浓度正相关。 双向免疫扩散 根据沉淀线形状，可鉴定两种抗原是否相同。 免疫电泳 常用于血清蛋白的组分分析 免疫火箭电泳rocketimmunoelectrophoresis 沉淀峰高度和Ag的浓度成正比 免疫比浊 在一定量抗体中分别加入递增率抗原，经一定时间后形成免疫复合物，以浊度计测量反应液体的浊度，根据标准曲线推算样品中抗原含量。 用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应 免疫荧光法: 直接荧光法 间接荧光法 酶免疫测定：酶联免疫吸附试验（ELISA） 双抗体夹心 间接法 BAS-ELISA 微粒捕获酶免疫分析技术 MEIA 酶联免疫空斑试验ELISPOT 免疫组织化学技术 放射免疫测定法 化学发光免疫分析 免疫印迹法 免疫PCR 免疫胶体金技术 蛋白质芯片技术 免疫荧光法 荧光素、酶或放射性核素等标记物标记抗体或抗原。 异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）等。 直接荧光法、间接荧光法。 酶免疫测定 pg/ml~ng/ml 辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP） 酶联免疫吸附实验（ELISA）或酶免疫组织/细胞化学法 ELISA 双抗体夹心法 间接法 BAS-ELISA 酶联免疫斑点实验 ELISPOT ELISPOT 酶联免疫空斑实验 思考： 做这个实验所使用的几种抗体有什么特殊要求吗？ 微粒捕获酶免疫分析技术 MEIA 将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素亲和素酶放大系统相结合，酶作用于荧光底物，使之发荧光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。 用于检测肿瘤标志物、性激素、甲状腺素、HCG等微量可溶性抗原。 免疫组织（细胞）化学 放射免疫测定法 高灵敏性，pg/ml。 125I、131I等。 化学发光免疫分析 吖啶酯、鲁米诺等发光物质 免疫印迹法Immunoblotting / Western blotting 免疫PCR 免疫胶体金技术 胶体金颗粒标记抗体或抗原 氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下聚合成特定大小金颗粒，因静电作用呈稳定胶体状态。胶体金颗粒聚集后呈红色。 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片：固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。 淋巴细胞的分离 外周血 淋巴细胞分离液 外周血单个核细胞 PBMC 淋巴细胞类型鉴定 免疫吸附分离法 免疫荧光法 磁珠分离法 流式细胞术 抗原肽-MHC分子四聚体技术 磁珠分离 荧光激活细胞分选仪分离法流式细胞术 鉴定荧光抗体单色、双色或多色标记的细胞。 分析细胞周期 分析细胞凋亡情况 流式细胞仪 抗原肽-MHC 分子四聚体技术 定量检测抗原特异性CTL。 T细胞功能测定 T细胞增殖实验 有丝分裂原（PHA、ConA等） 形态计数法：体积增大、形态不规则、胞质增多、胞核松散、核仁增多等。 3H-TdR或125I-UdR掺入法 MTT法 迟发型超敏反应的检测 如：PPD试验 B细胞功能测定 各类Ig含量的测定 单向琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等。 抗体形成细胞测定 溶血空斑试验 ELISPOT 细胞毒试验 检测CTL、NK细胞杀伤靶细胞活性的细胞学技术。 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞染色法：台盼蓝染死细胞 凋亡细胞检测法 凋亡细胞检测法 细胞形态学检测法 体积变小、形态变圆、胞质浓缩、内质网扩张、核仁消失、染色质浓缩成半月形或斑块状，最后形成凋亡小体。 琼脂糖电泳法：DNA区带图谱 流式细胞术：二倍体峰前出现亚二倍体峰 TUNEL法