过氧化物酶活力测定.ppt

实验二、过氧化物酶活力测定 酶活性的测定方法 按照对酶促反应时间的选择不同 固定时间法 连续监测法 （一）固定时间法 定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。 优点：简单。 缺点：难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。 注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30～60分钟为宜。 （二）连续监测法 定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。 原理： 该方法每隔一定时间（10s～60s）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线 优点: 能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。 缺点： 对环境要求高，要求能够精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能。 本实验过氧化物酶活力的测定就采用连续监测法。 过氧化物酶介绍 Peroxidase（简称POD）-生物体内一类重要的含血红素的抗氧化酶，广泛存在于植物体中 。 与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 POD在清除细胞内的有害物质过氧化氢和保护酶蛋白以及植物细胞中木质素的形成活动中有重要意义。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且研究发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，植物处于逆境时,过氧化物酶活性也会有变化。 测定原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚， 红棕色的产物在460nm、470nm处有吸收峰，可用分光光度法测定该酶的活性。 材料 本实验选用禾本科植物狗尾巴草为实验材料 仪器 722s型分光光度计、电子分析天平、高速冷冻离心机、微量移液器等 试剂 1、酶提取缓冲液：20mmol/L硼酸缓冲液（pH8.8），内含 5mmol/L亚硫酸氢钠（临用前加） 2、0.1mol/L醋酸缓冲液（pH5.4） 3、0.25%愈创木酚（溶于50%乙醇中）溶液（临用前配） 4、0.75%过氧化氢溶液（临用前配） 操作步骤 一、酶液提取 分别精确称取不同部位的植物样品0.2g左右，加入预冷的酶提取缓冲液约5ml，于研钵中研磨成匀浆（冰浴）,匀浆转入2支离心管，用少量(约1ml)缓冲液冲洗研钵一并转入,托盘天平平衡后于8000转/分钟离心15分钟（低温）。将上清液倒入刻度试管，定容至10ml，插入冰浴待测。 二、酶活力测定 1、打开光度计，预热20分钟左右，并做好比色前的准备工作（包括设置波长，比色皿清洗等）。 2、在光径为1cm的比色杯内，先加入2ml 0.1M的醋酸缓冲液和1ml 0.25%愈创木酚溶液，再加入0.2ml（根据反应情况调整）酶液，最后加入0.1ml 0.75%的过氧化氢溶液，然后迅速颠倒混匀并立即把比色杯插入比色架，盖上比色室盖子，并开始记时，每隔30秒在460nm处读取吸光度值，读至酶促反应2.5分钟为止，分别记下读取的5个数据。 3、重复以上测定 结果计算 1、求出前后两个数据的差值(共4个)，取4个差值平均值，即得到每半分钟每0.2ml的△OD470 。 ⊿A平均=(⊿A1+ ⊿A2+ ⊿A3+ ⊿A4)/4 2、以每分钟OD470nm变化0.01为1个活力单位(U)计算所有样品的酶活力单位数. 酶活力（U）=⊿A平均/（0.01×t）×D 3、求出所取材料过氧化物酶的活力，以U/g表示 酶的比活力（U/g）=⊿A平均/（0.01×W×t）×D 式中，⊿A平均——反应时间内吸光值的变化 W——植物鲜重，g； t——反应时间，min； D——稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶