生物之基础过关36(基因工程和细胞工程).doc

高三生物一轮基础过关（36）2016/12/20 编制人：祝群 一、基因工程 1．原理：定向基因重组，优点：克服远缘杂交不亲和的障碍 2．基因工程的基本程序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 第一步：目的基因的获取 1．工具：限制酶。作用特点：能识别特定的碱基（脱氧核苷酸）的序列，并在特定的位点切割；作用的结果：形成黏性末端或平末端；此种酶除了用来提取目的基因，还用来切割运载体；提取目的基因时该酶作用于DNA中的磷酸二酯键。 2．获取方法：从基因文库中获取；PCR技术；人工合成法（反转录法、化学合成法） （1）基因文库中包含了某种生物的全部基因，而cDNA文库是由mRNA反转录产生的，因此无基因中的启动子和基因中的内含子，包含某种生物的部分基因。 （2）PCR技术：DNA解旋（90-95℃）、引物结合（55-65℃）、互补链合成（70-75℃） ①此过程反应体系的主要成分包含：扩增缓冲液、水、4种脱氧核苷酸；两种引物、耐高温的DNA聚合酶、模板DNA等。 ②一个DNA经过4轮循环后同时含有两种引物的DNA片段所占的比例是7/8 ③设计引物的依据是目的基因两端的部分DNA序列 ④设计引物的注意点是：一是两种引物之间不能碱基互补配对；一种引物自身不能碱基互补配对而出现自身折叠。 ⑤此过程中退火（复性）的温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定，一般引物对中G-C含量高的可采用较高的退火温度。 第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤） 1．工具：限制性内切酶、DNA连接酶 2. 基因表达载体主要包括启动子（化学本质是DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，它的作用是启动目的基因的转录）、终止子、目的基因、标记基因（鉴定受体细胞中是否含有目的基因）、复制原点等。（记住组成及作用！） 3. 常见的运载体包括：质粒、动植物病毒、噬菌体衍生物，运载体具备的条件有：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点；具有标记基因。 4. 如果用同一种酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶处理，得到的产物有目的基因-运载体，目的基因-目的基因；运载体-运载体，而且目的基因和运载体相连的表达载体可能不能表达的原因是：反向连接。因此，针对上述问题，常采用双酶切切割目的基因和运载体，目的就是防止目的基因的任意连接和质粒的自身环化。 5. 构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传，同时能表达和发挥作用。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1. 受体细胞是植物细胞时常用的导入方法是：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法。 （1）农杆菌转化法：将目的基因与Ti质粒（含有T-DNA）结合构建基因表达载体、将基因表达载体导入农杆菌，再用含有重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞，利用T-DNA可转移的特点，将目的基因插入到植物细胞的染色体DNA上，再利用植物组织培养技术技术将导入了目的基因的植物细胞培养成新的植株。 2. 受体细胞是动物细胞时导入方法是显微注射法。常见的动物受体细胞是受精卵或者胚胎干细胞，原因是这些细胞的全能性高。 ★乳腺生物反应器： 将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射的方法，导入到哺乳动物的受精卵中，然后将受精卵送入母体，使其生长发育成转基因动物。 3.受体细胞是微生物细胞时导入方法是用Ca2+处理，使细胞变成感受态。 （1）基因工程常选择微生物细胞作为受体细胞的原因是：多为单细胞生物，遗传物质较少，繁殖快。 （2）当受体细胞是大肠杆菌时，由于该生物细胞内没有内质网和高尔基体，因此从中提取出的蛋白质还要经过人工修饰才具备生物活性，而受体细胞为酵母细胞时则不需要。 第四步：目的基因的检测与鉴定 注意：区别转录、翻译和表达（包括转录和翻译）的关系！ （1）初步筛选：通过表达载体上的标记基因检测目的基因是否导入受体细胞 （2）分子水平的检测： ①检测受体细胞中是否含有目的基因的方法是：DNA分子杂交技术（DNA-DNA） ②检测受体细胞中是否转录出相应的mRNA:分子杂交技术（DNA-RNA） （提醒：以上两种技术利用的检测工具都是单链DNA探针，该单链DNA探针是能和目的基因互补配对的带有放射性同位素标记的单链DNA片段。） ③检测受体细胞中是否表达出相关的蛋白质：抗原-抗体杂交技术（用相应的抗体和提取出来的蛋白质杂交） （3）个体水平的检测：需要做抗虫或抗病的接种实验等。 二、蛋白质工程 1、蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。 2．蛋白质工程的基本原理： 预期蛋白质功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的氨基