第二章生物制品的制备.解读.ppt

(3) 起始密码子和终止密码子的选择 ①如果标签蛋白在多克隆位点的前面，载体含有ATG，克隆基因最好从基因的ATG开始（前面5’非编码区的基因会翻译，如果从前面设计引物），这时基因的ATG不能作为起始密码子，只能是翻译成M，因为只有第一个ATG才能作为起始密码子，即标签前面的那个密码子。所以可以从ATG开始设计引物，加上保护碱基，不用加cozak序列。 但是下游引物必须要加上终止密码子。 ②如果标签蛋白在多克隆位点的后面，要看载体有没有自己带起始密码子，如果没有，那么引物要加ATG和cozak序列。 但是下游引物不加终止密码子，加了标签就不表达了。 （4）Kozak序列 存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。 核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。注意这段序列并不是ribosomal binding site (RBS)核糖体结合位点，而是帽子结构 。 真核生物基因中起始密码子上下游的最佳序列为，-3位为嘌呤碱基；+4位为G，起始密码子AUG中的A处于+1位。A/GCCAUGG被称为kozak序列或扫描序列。 (5) 移码突变-补碱基 如果酶切位点不是整个3个碱基的倍数，就要根据多克隆位点上改酶切位点补足3连体，使ATG前面是三联体，不然会造成移码突变。 ECORI酶切位点 ：GAATTC BamHI酶切位点 ：GGATCC (6) 利用引物设计软件设计引物 F: 5’CCG G /AAT TCA ATG CCG CTC TAC TCC GTT ACT G 3’ (TM 63.3； GC 52.3) (EcoR1) R: 5’ CGCGGATCC TTC TAC GAA GAC AGT TTT TGG 3’ (BamH1) 标签蛋白在多克隆位点的后面 F: 5’ cCG G/AAT TCA GAC ATG ACA GAA GAA CAG TTA GC 3’ (TM 53.7; GC 43.5)(EcoR1) R: 5’ CGCGGATCC TTA CTG TTC ACT TTC CTC TTC C 3’(TM 53.4; GC 40.9)(BamH1) 标签蛋白在多克隆位点的前面 4 cDNA模板的制备 用Trizol试剂提取样品的总RNA，反转录合成cDNA。 引物：随机引物 、Oligo(dT)和特异引物 反转录酶：鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶 、禽成 髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶 5 PCR扩增目的基因 常用PCR扩增的体系（25μL）和条件 程序： 95℃ 变性5min；94℃ 变性30s， 52℃ 退火30s， 72℃延伸40s， 30 个循环； 72℃延伸10min ddH2O 17μL 10×buffer 2.5μL dNTP 1μL 上游引物 1μL 下游引物 1μL 模板 2μL Taq 酶或 Pfu高保真酶 0.5μL 用限制性内切酶将PCR产物（胶回收）和载体进行酶切，用清洁试剂盒清洁后，用T4连接酶将酶切后的目的基因插入载体的相应酶切位点。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于抗性平板，筛选阳性转化子。 二、目的基因与载体的重组 转化的细菌涂布接种到抗性平板 用无菌牙签将单菌落转移至含Amp的液体培养基，振荡过夜 Amp 37℃过夜 Amp 提取质粒 PCR鉴定、双酶切鉴定重组质粒 基因测序 原核载体：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。 真核表达系统：酵母、昆虫细胞、哺乳类细胞、转 基因动物、转基因植物等。 三、重组质粒转化（转染）适当的表达宿主 细胞表达目的蛋白 克隆表达的路线 目的DNA片段和载体的连接 目的DNA片段和载体的制备 连接产物的转化 重组子筛选 目的蛋白的诱导表达 目的蛋白的纯化 表达的目的 载体的选择 引物的设计是关键 什么是克隆？ 目的基因的克隆及其原核表达 技术路线 RNA Extraction Vector T Vector T PCR Product A A pET -HE HE HEV RT-PCR 转化DE3 HE蛋白 ITPG诱导 大肠杆菌 下游技术 对于下游工作，并无明确的定义。一般是指在构建了工程菌后，进行大规模的工程菌培养（发酵）、分离纯化、制剂及质量控制（检定）等一系列工艺技术。其中的分离纯化技术是极其重要的一环，有时又将生物制品的这一环节称为后处理，它包括破菌、固液分离、浓缩、纯化直至得到纯品。 二、下游技术