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第二章植物细胞工程.解读.ppt

发布:2016-04-06约字共50页下载文档
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第三节 植物原生质体技术及应用 一、原生质体分离方法及原理 二、分离原生质体的操作程序 三、原生质体培养 四、原生质体融合 五、原生质体的遗传饰变 一、原生质体分离 分离方法:机械法 酶法 果胶 纤维素和半纤维素 酶法的原理: 降解果胶,使细胞分离 降解纤维素或半纤维素去除细胞壁,使裸露的原生质体游离出来 细胞壁的主要成分:纤维素和半纤维素 细胞间由果胶物质黏连在一起 酶的种类: 纤维素酶类(Cellulase):Onozuka R-10 果胶酶类(Pectolyase) 半纤维素酶类(Hemicellulase) 酶液的准备 渗透压稳定剂:甘露醇、山梨醇等糖醇 pH值调节至5.6左右 用0.45μm的细菌过滤器进行除菌处理,冷冻保存 二、分离原生质体的操作程序 过滤、离心 加果胶酶 和纤维素酶 取材 消毒 处理 分离纯化 植物材料的消毒和处理:叶片、茎段、花瓣等 水洗 消毒 无菌水冲洗 2. 酶液处理:材料与酶液按1:10的比例; 处理温度:25-28 ℃; 黑暗或弱光照; 低速摇动(35-40r/min); 处理时间:通常 3-18h 二、分离原生质体的操作程序 3.原生质体的收集与纯化 离心沉淀法 原理:应用原生质体的比重大于溶液,离心后原生质体沉于底部。 步骤: 第一步:原生质体溶液用40-80μm尼龙网筛过滤。 第二步:离心(600-1000r/min,离心3-5min)。 第三步:吸去上清液,洗涤液重新悬浮,再离心沉淀。 第四步:用原生质体培养液洗1次,收集原生质体。 界面法:1973年Kanai和Edwards创立 选两种不同渗透浓度的溶液,其中一种溶液密度大于原生质体的密度,另一种溶液小于原生质体的密度。 界面法进行原生质体纯化 碎片带 原生质体带 0.45mol/l 蔗糖 0.45mol/l 蔗糖 酶解产物+原生质体培养基( 0.45mol/l甘露醇) 400g, 离心5min 纯度高 活力高 4.原生质体计数及活力检测 计数:原生质体经分离和纯化后,需要进行活力测定和计数。原生质体培养时有一种密度效应,一般104-5个/mL有利于培养。计数可用血球计数板进行(个/ml) 活力测定: 1、形态识别:形态上完整,呈圆形,含有饱满的细胞质,颜色鲜艳的即为存活的原生质体。 2、染色识别 0.1%酚番红:活的原生质体能吸收而呈红色,死的则无此能力; Evans蓝染色:有活力的不被染色,死原生质体可吸收被染上色。 双醋酸酯荧光素(FDA)染色法:FDA本身没有荧光和极性,可自由渗透进出完整质膜。活的原生质体的酯酶能分解FDA成为具有荧光的极性物质,无活力的不产生荧光。 活力测定: 第二章 植物细胞工程 细胞工程(cell engineering)是应用细胞生物学和分子生物学原理,借助工程学的试验方法和技术,在细胞水平上研究和改造生物遗传特性和其他生物学特性,以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的技术。 本章的主要内容 第一节 植物细胞培养 第二节 植物细胞培养的应用 第三节 植物原生质体技术及应用 第一 节 植物细胞培养 植物细胞培养(plant cell culture):指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或小细胞团)进行培养,形成单细胞无性系或再生植物的技术。 植物细胞培养的意义: (1)研究细胞生理代谢过程及各种影响因子; (2)用于植物品种的改良; (3)用于植物次生代谢物质的生产。 单细胞培养 细胞的悬浮培养 培养类型 一、单细胞培养(通常以叶片为材料) (一)单细胞的分离 分离方法:机械法和酶解法。 机械捣碎法 将外植体捣碎,然后通过过滤和离心分离细胞。 优点:不用酶,细胞不会受到伤害;没有经过质壁分离,利于生理生化研究。 缺点:机械作用,细胞结构破坏大,得率低。 最佳材料:叶片 方法及步骤: 第一种方法:用刀片刮叶片 第二种方法:先把叶片轻轻研碎,然后通过 过滤和离心净化细胞。 叶片表面灭菌→切成小于1cm2的小块→玻璃匀浆管中匀浆→过滤(孔径分别为:61?m和38?m)→低速离心,弃上清→悬浮细胞→细胞培养 酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理,分离出具有代谢活性的细胞;该法不仅能降解中胶层,而且还能软化细胞壁。所以在用酶解法分解细胞的时候,必须对细胞给予渗透压保护。常用的渗透压保护剂是甘露醇。 首次成功:烟草叶细胞 步骤:叶片表面灭菌→撕去下表皮→切成4cm2小块→放入酶液中→抽真空→摇床上酶解→每30mi
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