荧光定量PCR技术讲座20170525XYY.ppt

北京康为世纪生物科技有限公司 总机：010???? 免费电话：?4006-222-360 网址： E-mail: ask@ * * * * 实时荧光定量PCR (Real time Quantitative PCR) 北京康为世纪生物科技有限公司 Real time Quantitative PCR PCR：伟大的天才发明 Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substances Belief in astrology PCR：理想与现实 起点定量 终点定量 起点定量检测： -- 起点量是样本中未经PCR放大之前的模板量 -- 具有重现性，误差小 -- “加入了500个拷贝” 终点定量检测： - 终点产物量经过PCR放大的DNA量 -- 不恒定，误差大 -- “生成了500，0000，0000个拷贝” 确定模板初始数量‘real-time’使qPCR成为可能 起始模板量 Ct值 指数扩增期 平台期 Real-time PCR: 检测原理 非特异性荧光标记： SYBR Green I 特异性荧光标记： 水解探针： TaqMan 非水解探针：Molecular beacon R Q Reporter Quencher R Q 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG Emission Excitation SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。 SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。 荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。 SYBR Green I 工作原理 Taqman 工作原理 在退火过程中，探针与靶序列结合 探针被Taq酶的5’- 3’ 外切酶活性剪切成片断 游离报告基团发出荧光 在延伸过程中，探针部分与靶序列分离 荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。 染料法与探针法 对比 探针法 特异性高 -- 与探针与特异靶序列结合 对模板有选择性 -- 可进行多重PCR反应 成本高 -- 不同靶基因需要合成不同探针 染料法 通用性好 -- 对DNA模板没有选择性 使用方便，成本低 -- 仅需设计两个引物 有假阳性现象 -- 通过融解曲线判断 Real-time PCR 应用 基因表达分析 -- 相对定量：基因表达量的差异 -- 绝对定量：样本中核酸的量（拷贝数、微克） 基因型分析 -- SNP检测 等位基因检测 甲基化检测 基因表达分析检测 test sample 处理样本 target gene 目的基因 reference gene 内参基因 total RNA cDNA total RNA cDNA calibrator sample 对照样本 target gene 目的基因 reference gene 内参基因 qPCR qPCR 以各自样本中内参基因为标杆， 比较两样本中目的基因的相对丰度。 数据分析 基因表达分析检测 内参基因(housekeeping gene)选择 样本处理与 RNA提取 – cDNA – qPCR 内参基因的选择 特点 选择内参基因 内参基因 beta-actin、 GAPDH、 18S rRNA、 28S rRNA等 -- 文献检索 -- 实验筛选 选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准 内参基因Housekeeping Gene -- RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。 对样本初始浓度差异进行均一化校正。 不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。 Housekeeping Gene 康为产品 不同丰度： 高丰度 ACTB、GAPDH 中等丰度 beta2M 低丰度 HPRT1 不同物种： 人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗 等 基因表达分析检测 样本处理与 RNA提取 – cDNA – qPCR 内参基因(housekeeping gene)选择 样本处理与RNA提取 外界刺激 – 10分钟 – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 – 2分钟内 –固定、裂解细胞 RNA样本保存液 Trizol 超纯RNA