实时荧光定量PCR技术重点讲义.ppt

试剂的处理与保存条件 Reagent Storage Temp. Storage State Taq DNA polymerase –20oC Not Critical 10X PCR Buffer –20oC Not Critical 50 mM MgCl2 18–24oC Not Critical 100 mM dATP Solution –20oC Not Critical 内掺染料 –20oC Dark 软件设置 演示 结果分析 标准视图： 差异视图： 1. 突变发现/筛查/扫描 2. SNP 基因分型/等位基因区分 3. 物种鉴定 4. 甲基化位点的筛查/甲基化程度分析 5. 法医学鉴定、亲子鉴定。检测单核苷酸多态性SNP鉴定，插 入/缺失多态性DIP鉴定等??? HRM应用 可以区分单碱基差异 HRM基因分型不需要设计特异性的TaqMan探针，只是通过溶解曲线的分析来区分等位基因，从而大大降低了检测成本。 使用两种不同的等位基因特异性正向引物，正向引物3’ 端的最后一个碱基对应于SNP位点的两等位基因，反向引物都一样，并使用荧光染料来检测PCR产物。纯合子基因组DNA只能被与其完全匹配的正向引物扩增，而杂合子基因组DNA能同时和两种正向引物结合扩增出两种PCR产物。 HRM应用 HRM区分单碱基差异 同源双链（Homoduplex） 纯合子通过Tm值（CT）容易区分 T A C G HRM应用 T A C G HRM区分单碱基差异 异源双链 + + T A C G + T G C A 杂合形的样品在经过扩增后形成四种不同双链的混合，其中G:C、A:T的混合使杂合型的熔解曲线表现为前两种熔解曲线的整合形，而A:C、G:T的错配双链使它的熔解曲线更趋向低温区，综合以上使杂合型的熔解曲线与纯合型的熔解曲线呈现交叉。 HRM应用 已知SNP分析 Factor V Leiden（G1691A）突变的HRM检测。 HRM应用 种属鉴定 临床分枝杆菌的鉴定。对临床细菌的培养物进行16SrDNA的实时扩增，并进行HRM分析，每个菌种的熔解曲线模式就如同该物种的分子指纹，从而可以根据HRM的不同对细菌种属进行鉴定。 HRM应用 DNA甲基化及程度分析 用HRM方法检测MGMT启动子区域内的甲基化，可检测低达0.1%的甲基化程度；根据已知甲基化程度的标准曲线可对未知样品的甲基化百分比进行测定。HRM是一种高灵敏度的甲基化检测方法，并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床应用有很大帮助。 HRM应用 * * * * * * * * * This is analyzed or normalized data. This is two homozygote samples, differing by one base pair, a C homoduplex and a T homoduplex and are easily differentiated by difference in Tm. Knowing this you can easily predict that the green is the T because of the two hydrogen bonds and the red is the C, for it has stronger 3 hydrogen bond and will melt later. * * This is analyzed or normalized data. This is two homozygote samples, differing by one base pair, a C homoduplex and a T homoduplex and are easily differentiated by difference in Tm. Knowing this you can easily predict that the green is the T because of the two hydrogen bonds and the red is the C, for it has stronger 3 hydrogen bond and will melt later. 基因有限公司 市场部 潘娜 Tel: 010256 Email: panna@ 实时荧光定量PCR 技术、应用及产品 实时荧光定量PCR定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量