文档详情

免疫分子生物学临床寄生虫学检验.ppt

发布:2019-05-21约8.3千字共72页下载文档
文本预览下载声明
(3)特点 ①极度敏感:以指数方式扩增目的DNA序列 经30个左右循环,扩增倍数可达原来的106。 例如:对疟原虫的检测可达 2μl 血中1个虫体 ②特异性较好:设计特异的引物 避免 DNA 的污染 使用一次性器材 使用最适MgCl2浓度 ③有确诊价值 ④检测条件要求较高,费用较昂贵 (4)适用范围 ①疟疾、弓形虫病和利什曼病等原虫病的诊断 1996年,Khoo用P.f 18S ssRNA基因设计的引物进行巢式PCR可检出低原虫血症10 -6。 巢式PCR可检出1升污水中100个隐孢子虫卵囊。 巢式PCR检测弓形虫P30基因,敏感性可达0.05pg。 Siridewa报道建立了班氏丝虫PCR检测技术。从病人血液和鞘膜积物中提取微丝蚴DNA 模板,检出0.1-1 ml 中1条微丝蚴。 * ②丝虫病、恙虫病和棘球蚴病的诊断 * (二)DNA探针 DNA 探针是指用同位素、生物素或酶以及其它一 些半抗原标记的特定DNA 片段,在与样品DNA 杂交过程中, 借助标记物将这些特异性或差异性DNA 序列探查出来。这一技术主要包括Southern、Nor thern 和斑点杂交、原位杂交等。 1984年, Faranzen首次从恶性疟基因组DNA 文库中分离出一个含有21 个碱基对(bp)单元的重复序列,用32P 标记后进行分子杂交, 可检出10 -5原虫血症, 并具高度种特异性。 1986年,Barker 等用斑点杂交法将DNA 诊断技术用于疟原虫现场。 1988年,张兆松等报道恶性疟FVO 株基因组DNA 探针的斑点杂交, 敏感性达到7 ×10 -6原虫血症水平。 * * 附: ELASA间接法操作: 1)以包被液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液0.05mol/L,pH9.6)稀释抗原(具体稀释倍数按具体虫体要求),每孔0.1(或0.2)ml包被反应板,37℃湿盒温育2~3小时或4℃过夜; 2)弃去包被液,反应板用去离子水或PBS-Tween液(0.005mol/L PBS含0.05%Tween-20)冲洗3次,甩干; 3)用样本稀释液(0.05mol/L PBS含0.05%Tween-20)稀释样本(起始浓度≥100-1),用样本稀释液(每孔0.1(或0.2)ml,温育1小时; * 4)弃去样液,如上冲洗,甩干加稀释结合物,每孔0.1 (或0.2)ml,温育1~2小时; 5)如上冲洗甩干后即刻加入新鲜配制的底物系统,每 孔0.1(或0.2)ml,置暗盒室温15分钟; 6)终止反应:HRP-OPD系统每孔加1mol/L H2SO4; 7)目测或用分光光度计在490nm波段测定吸收值来判 断。 * 间接血凝实验操作: (1)红细胞鞣化和致敏  ① 取醛化红细胞用0.15mol/L,pH7.2 PBS离心洗涤2次, 并用PBS配成2.5%悬液; ② 加等量1:2000鞣酸溶液(鞣酸不同批号,质量相差较大必 须预试测定适宜浓度)37℃孵育20分钟,经常摇动; ③ 离心去上清,PBS洗1次,再用0.15mol/L,pH6.4 PBS 配成10%悬液; ④每份悬液加等量适当稀释的抗原液,置于37℃水浴箱中30 分钟(每5分钟振动一次),离心去上清,pH7.2PBS洗2 次,再用含1%正常兔血清(NRS)10%蔗糖缓冲液配成5 %细胞悬液。加1‰叠氮钠防腐,存4℃或减压冻干备用, 每批致敏细胞均需用已知阳性和阴性血清滴定灵敏度或特 异性。阳性滴度在1:640以上,阴性血清不出现反应者可 用。 * ( 2)微量血凝试验 在U型(或V型)微量血凝板上,将被试血清用1%NRS或BSA生理盐水作倍比系列稀释,每孔含稀释血清0.05ml。每孔加0.01ml致敏红细胞悬液,充分振荡摇匀,加盖于室温静置1~2小时读取结果。 * 谢谢! * (1) 酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay.ELISA) 应用最为广泛,目前,国内外已开发出多种寄生虫病快速ELISA诊断试剂盒用于临床。包括有日本血吸虫病、弓形虫病、肝吸虫病、卫氏并殖吸虫病、猪囊虫病、阿米巴病、旋毛虫病、利什曼原虫病、裂头蚴病和棘球蚴病等,ELISA可用作辅助诊断病人、血清流行病学调查和监测疫情的方法。 * 双抗体夹心法:用于检测抗原 包被
显示全部
相似文档