分子生物学技术选讲.pdf

分子生物学技术选讲 蛋白质组研究方法 ?双向电泳: 第一向：等点聚集电泳 第二向：SDS ?质谱（MS） 等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极 之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的 作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位 置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质 之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI 蛋白质的双向电泳 鉴定特定生物分子是否存在的技术 ?Southern印迹 ?Northern印迹 ?Western印迹 ?Farwestern印迹 ?Southwestern印迹 ?Eastern印迹 各种印迹技术 印迹类型 转移到膜 探针 获得的信息 上的分子 Southern DNA 放射性标记的互补RNA或DNA 基因结构等 Northern RNA 放射性标记的互补RNA或DNA 特定RNA的大小、分布和含量 Western 蛋白质 一级抗体和与酶偶联的二级抗 特定蛋白质的大小、分布和含 体 量 Farwestern 蛋白质 放射性标记的蛋白质 蛋白质与蛋白质的相互作用； 与特定蛋白质相互作用的蛋白 质的大小、分布 Southwestern 蛋白质 能够与特定蛋白质结合的放射 特定DNA或RNA结合蛋白质 性标记的DNA或RNA 的大小、分布和含量 Eastern 受到各种 取决于检测的化学修饰的类型 蛋白质的后加工 化学修饰 的蛋白质 确定一个基因是不是断裂基因的方法 ? R环技术 研究基因功能的方法 ?基因敲除：同源重组和转座子插入 ?基因敲减：干扰RNA ?显性负性突变：通过基因转移将突变的 蛋白质大量引入到在特定细胞内表达， 以阻断正常蛋白质的功能，从而推断野 生蛋白质的功能。 蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法 ?酵母双杂交 ?免疫共沉淀 ?亲和层析 ?共价交联 ?荧光共振能量转移 ?生物发光共振能量转移 酵母双杂交系统 ? 是一项专门用来研究蛋白质与蛋白质相互作用 的技术，它首先由Fields S和Song OK于1989年 提出。这项新技术在验证已知蛋白质之间的相 互作用或筛选与特定靶蛋白呈特异性作用的候 选蛋白的研究中已经得到了广泛的应用。其可 行性和有效性已被证实，并被推广到了诸如信 号传导、细胞周期调控、肿瘤基因表达等多个 研究领域，受到越来越多的重视。 酵母双杂交系统的原理 ? 酵母双杂交系统技术使用蛋白质的两种具有特别功能的结构域： 一种是与DNA结合的结合结构域（简称BD），另一种是激活 DNA转录的激活结构域 （简称AD）。研究表明，这两种结构域 并不需要一定在同一个蛋白质上才起作用。事实上，一个含有BD 的蛋白质在与另一个含有AD的蛋白质结合以后就可以激活转录， 该原理构成了酵母双杂交技术的基础。 ? 在双杂交系统中，两种融合蛋白被表达：一种是目标蛋白—X， 它有时被形象地称为诱饵蛋白。X在它的N-端与BD融合在一起； 另一种是潜在的能够与X结合的目标蛋白—Y。Y与AD融合在一 起。如果X与Y相互作用，那么XY的结合就形成一种完整的活性 转录激活物。如此形成的转录激活物能够驱动一个容易检测的报 告基因的表达。于是，报告基因的表达量可以用来作为测定X与Y 相互作用的尺度。 酵母双杂交系统的原理图解 酵母双杂交系统的建立 ? 选择载体 ? 将“诱饵”蛋白X的基因和目标蛋白Y的基因 分别插入到BD载体和AD载体之中，以形成 BD-X和AD-Y融合蛋白 ? 转染：使用特定的手段将重组后的BD-X载体 和AD-Y载体转染到特定的营养缺陷型酵母宿 主细胞； ? （4）筛选：利用双营养缺陷型的恢复