自学内容2分子杂交技术.ppt

分子杂交与印迹技术01MolecularHybridizationBlottingTechnology02一、分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂交双链(heteroduplex)。复性RNADNA（一）印渍技术

Blotting首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质上并加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测。二、印渍技术的类别及应用DNA印迹技术SouthernblottingRNA印迹技术Northernblotting蛋白质印迹技术Westernblotting斑点印迹Dotblotting原位杂交insituhybridizationDNA点阵DNAarrayDNA芯片技术DNAchip（一）DNA印迹技术

Southernblotting又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析，是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；01经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过电转移将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。02附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。03基本方法SouthernBlottingPaperTowelstissueSDS蛋白酶K酚/氯仿无水乙醇离心STEP4STEP3STEP2STEP1RNA印渍技术Northernblotting又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。蛋白质印渍技术Westernblotting又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。三种印迹技术的比较DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。Southern杂交的主要步骤待测DNA样品的制备、酶切待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备Southern杂交杂交结果的检测Northern印迹杂交(Northernbloting)检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳转膜：不需变性Western杂交印迹法(Westernbloting)检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：蛋白质样品的制备聚丙烯酰胺凝胶蛋白质的电转移：尼龙膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应斑点印迹

Dotblotting斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。01原位杂交02insituhybridization03即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞