基因工程原理及实验的考试重点.doc

基因工程的概念： 1.限制性内切酶:识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键，在特定部位限制性地切割 DNA分子。 2.Southern杂交:将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。 3.Northern杂交:是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 4.反义RNA技术:反义RNA 是指与靶RNA 具有互补序列的RNA 分子, 它通过与靶RNA 进行碱基配对结合调节结构基因的表达。 二.需要了解的简单知识 1.限制性内切酶的分类 Ⅰ型限制性内切酶：多聚体蛋白质，具有切割DNA的功能，作用时需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸的存在。切割DNA的方式是，先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿着DNA分子移动，在行进相当于1000~5000个核苷酸的距离之后在随机位置上切割单链DNA。 Ⅱ型限制性内切酶：分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要Mg2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段。 Ⅲ型限制性内切酶：是一些具有独特的识别方式和切割方法的内切酶。 基因工程工具酶种类及其功能 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 PCR技术原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火 复性 ：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的模板DNA 链。 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 基因工程在食品产业中的应用 利用基因工程改造食品微生物 1.改良微生物菌种 2.改良乳酸菌遗传特性 3.酶制剂的生产 利用基因工程改善食品原料的品质 1.改良动物食品性状2.改造植物性食品原料 利用基因工程改进食品生产工艺 1.利用DNA重组技术改进果糖和乙醇生产方法 2.改良啤酒大麦的加工工艺 3.改良小麦种子贮藏蛋白的烘烤特性 4.改善牛乳加工特性 利用基因工程生产食品添加剂及功能性食品 1.生产氨基酸 2.生产黄原胶 3.超氧化物歧化酶（SOD）的基因工程 4.应用于生产保健食品的有效成分 基因工程的操作步骤 目的基因的获得与序列分析 目的基因与载体的连接（重组与克隆） 重组DNA向受体的转化 植物细胞转化技术 重组体的筛选与外源基因的鉴定 反义基因技术的特点 反义技术具有明显的优点： （1）反义核苷酸是针对特定的靶mRNA（DNA）的序列设计合成，具有极高的特异性，不影响其他基因的表达； （2）反义核酸是针对已知序列的靶基因设计合成的，由于靶基因序列已知，反义核酸仅有15-30个碱基，结构简单，容易设计和体外大量合成。 （3）反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构，可省去对基因产物的研究工作。 （4）反义基因进入细胞内与细胞周期无关，既可进入增殖期细胞又可进入非增殖期细胞。（5）反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传，类似于遗传上的缺陷型，表现为显性，后代符合孟德尔遗传规律。 （6）反义寡核苷酸不含病毒序列，不会产生免疫反应，也不会整合入宿主染色体内。 反义基因不改变目的基因的结构，在应用上更加安全。 反义技术的缺点： 反义基因有毒副作用 反义基因的半衰期短； （3）反义基因的转移与吸收效率不高。尤其是局部腔内转移系统，靶组织吸收反义核酸的效率比较低，影响其作用效果； （4）在临床上，靶基因的选择，反义基因的最佳应用剂量和最佳作用时间不好把握， 理想基因工程载体应具备哪些特征？ 能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在外源DNA插入其DNA之后，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性。 易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。 在其DNA序列中有适当的限制性内切酶单一切位点。这些位点位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影