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基因工程原理

??摘要：本文详细阐述了基因工程的基本原理，涵盖了基因工程的定义、工具、操作步骤以及应用等方面。通过对基因工程核心概念和技术的介绍，使读者对这一现代生物技术有较为全面和深入的理解。

一、引言

基因工程作为现代生物技术的核心领域，对人类社会的发展产生了深远影响。它打破了物种之间的遗传壁垒，能够按照人们的意愿对生物的遗传信息进行定向改造，为解决农业、医药、环境等诸多领域的问题提供了强有力的手段。了解基因工程原理是掌握这一技术并推动其不断发展的基础。

二、基因工程的定义

基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等现代生命科学理论为基础，按照预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。

三、基因工程的工具

（一）限制性核酸内切酶

1.作用机制

限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA双链，产生黏性末端或平末端。例如，EcoRⅠ识别的序列是5GAATTC3，在G和A之间切割，产生的黏性末端为5AATT3和3CTTA5。

2.分类

主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅱ型限制性核酸内切酶应用最为广泛，因其识别位点明确，切割位点专一，是基因工程中常用的工具酶。

（二）DNA连接酶

1.作用

DNA连接酶可将具有相同黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成磷酸二酯键。在基因工程中，它用于将目的基因与载体连接，构建重组DNA分子。例如，T4DNA连接酶能催化双链DNA片段互补黏性末端或平末端之间的连接。

2.连接方式

对于黏性末端，连接酶能直接将互补的末端碱基对连接；对于平末端，则需要较高浓度的连接酶和辅助因子，连接效率相对较低。

（三）载体

1.具备的条件

能够在宿主细胞中自主复制，如质粒载体在细菌细胞内可独立复制。

具有多个限制性核酸内切酶的切割位点，便于插入目的基因。

带有可选择的标记基因，如抗生素抗性基因，用于筛选含有重组载体的宿主细胞。

2.常见类型

质粒载体：是一种双链闭环的小型DNA分子，存在于许多细菌中。它结构简单，易于操作，是基因工程中最早使用的载体之一。

噬菌体载体：如λ噬菌体，其基因组较大，可容纳较大片段的外源DNA。经过改造后，可用于构建基因文库等。

病毒载体：如逆转录病毒载体、腺病毒载体等，能高效地将外源基因导入细胞，常用于基因治疗和基因表达研究。

四、基因工程的操作步骤

（一）目的基因的获取

1.从生物基因组中直接分离

对于一些已知序列的简单基因，可以通过物理方法（如密度梯度离心、凝胶电泳等）或化学方法（如异硫氰酸胍法等）从生物基因组DNA中分离目的基因。例如，从细菌基因组中分离编码某种抗生素抗性的基因。

2.人工合成

根据已知的目的基因序列，利用DNA合成仪通过化学合成的方法制备目的基因。当目的基因较小且序列已知时，人工合成较为方便快捷。

3.PCR扩增

以目的基因的一段已知序列为模板，设计合成一对引物，通过聚合酶链式反应（PCR）大量扩增目的基因。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，是获取目的基因常用的方法之一。例如，以cDNA为模板扩增编码特定蛋白质的基因。

（二）基因表达载体的构建

1.载体的选择与准备

根据实验目的和宿主细胞类型选择合适的载体，如在大肠杆菌中表达可选择质粒载体。然后用限制性核酸内切酶对载体进行切割，使其产生与目的基因互补的黏性末端或平末端。

2.目的基因与载体的连接

将切割后的载体与目的基因在DNA连接酶的作用下进行连接，形成重组DNA分子。连接后的重组载体应具备完整的复制原点、合适的筛选标记基因以及正确连接的目的基因。

（三）将目的基因导入受体细胞

1.转化

对于细菌等原核生物受体细胞，常用的转化方法有氯化钙法。将重组载体与处于感受态的细菌细胞混合，使细菌细胞能够摄取重组DNA分子。例如，将含有重组质粒的载体导入大肠杆菌细胞。

2.转染

对于真核细胞受体细胞，常用的转染方法有脂质体介导法、电穿孔法等。脂质体介导法是利用脂质体与DNA形成复合物，然后将其导入细胞；电穿孔法则是通过短暂的高压电脉冲使细胞膜产生小孔，从而允许重组DNA分子进入细胞。例如，将外源基因导入哺乳动物细胞。

3.显微注射

直接将含有目的基因的DNA溶液注射到动物受精卵的细胞核内，然后将受精卵移植到受体动物子宫内发育。这种方法常用于制备转基因动物，如转基因小鼠。

（四）目的基因的检测与鉴定

1.分子水平检测

核酸分子杂交：包括Southern杂交（用