实验三基因序列查找及PCR引物设计教程.ppt

长江师范学院生命科学系 一、实验目的 1、掌握PCR扩增原理； 2、学会在NCBI网站上查找相关生物信息； 3、学会利用Primer5软件设计引物 我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为一个发明家,重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案 三、基因序列查询 BCBI（美国国立生物信息中心） 主页： / Mapview： /mapview/index.html 四、引物设计 引物设计有3条基本原则： 1、引物与模板的序列要紧密互补 2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配) 引物设计考虑的主要因素 1、引物长度：一般18-24个碱基对 2、相似性较高序列 3、引物二聚体或发夹结构 4、引物序列的GC含量：一般为40-60% 五、作业 1、在NCBI上查找一段基因序列，将碱基序列抄在实验报告上，标明基因名称、基因编号。 2、利用Primer5 软件设计一对与你查询基因序列相应的PCR扩增引物。 生化与分子生物学实验（二） 实验三 基因序列查找及PCR引物设计 陈发波 二、聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）: 是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。 PCR基本原理 反应材料 模板DNA 引物对 按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计； DNA聚合酶：耐高温 Taq DNA polymerase、Pfu DNA polymerase dNTP 缓冲液溶液 Mg2+, Tris缓冲液溶液等 PCR反应步骤 DNA解链（变性） 引物与模板DNA相结合（退火） DNA合成（延伸） 重复以上三个步骤 经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n 。 反应仪器 PCR仪 变性：94℃ 退火：50-60℃ 延伸：72℃ 循环数：20-30次 PCR仪 最终产物 紫外光观察 2-3 小时 凝胶成像系统 混合液 电泳 Kary B. Mullis (1944 -) / * *