PCR引物设计原理.PPT

平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而TTGGCG德频率很低，约300。 ΔG，序列内部碱基稳定性窗口 显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚体的自有能)。 -1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6） ΔG值反应了序列与模板的结合强度； 最好引物的ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。 在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能ΔG表示。 dA dC dG dT dA -1.9 -1.3 -1.6 -1.5 dC -1.9 -3.1 -3.6 -1.6 dG -1.6 -3.1 -3.1 -1.3 dT -1.0 -1.6 -1.9 -1.9 第二个核苷酸 第一个（5’）核苷酸 例子：双链d（ACGG/CCGT）的ΔG是： ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG） =-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol 显示了3’末端序列ΔG值较低，适合引发。 3’末端序列ΔG太高。 你可以在三个窗口中自行设计引物。 选择了自己认为顺眼的位置，此时，点击Uper，上游引物即可显示。 同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。 对你设计的引物 质量进一步分析。 同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。 参数设置与搜索选择search→for primers and probes，进行如右图设置。 点击search ranges，设置引物范围和 PCR产物的大小 点击parameters，进行参数设置。 因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都要选上。同时选compatible pairs 默认下，对引物的要求：无二聚体、3’高度特异、GC%含量有限定、去除错误引发引物等。 引物的长度及产物的长度设置。 Primer Length设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要; PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊。上限没有太多的限定。 普通设置、参数及更多参数 从高到低六个等级的设定，最后有一个用户定制选项。当对软件功能不了解时，应选very high/High。 选automatically change string 后，搜索引物时，如果在高等级设定中无法搜索到引物对时自动降级一个等级来搜索，直到找到为止。 反向引物时用 让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE（prime Efficeince）值（引发效率）。 可以限定所选引物对的最大数目。 实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据实验需求做相应改动。 其他的参数就使用Oligo默认值，一般无需改动。 直接使用Oligo默认值，一般也无需改变。 参数设置完毕后，点击确认OK，程序即进行引物搜索。 引物搜索结果如入： Oligo提供了按引物位置、产物大小、退火温度、GC含量等的排列方式。 Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了多种分析方法并以不同的形式展现出来。 选择其中的一对引物，这时程序自动弹出一个PCR分析窗口。 PCR optimal annealing temperature （最佳退火温度）数值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 产物Tm值与引物Tm值（低的那个）的差异，一般控制在20度以内。 引物间Tm值的差异，一般控制在5-6度以内。 引发效率：上（下）引物对于正、负链正确引发效率比。 最佳引物浓度 在Analyze 菜单中，Oligo 提供了众多分析功能。选择相应的功能，分析结果。 点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息; 其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高; 引物的Delta G和3’端的Delta G: 3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。 Key Info Duplex formation ，引物二聚体 引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素→应避免，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其ΔG值应该偏低→由退火温度决定，50°的退火温度和65°对二聚体的影响肯定不一样。 The most stable 3’-Dimer Delta G绝对值一般不要超过4.5kcal/mol。△G绝对值越大结构越稳定。 结合碱基对不要超过3个。 the most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/