奶牛活体采卵技术规程.docx

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奶牛活体采卵技术规程

范围

本文件规定了奶牛活体采卵技术中采卵室的基本要求、供体牛筛选与饲养管理、供体牛卵巢刺激前评估、供体牛卵巢刺激程序、活体采卵操作、卵母细胞分级鉴定的技术要求。

本文件适用于奶牛活体采卵技术及其他相关领域的科研需求。

规范性引用文件

本标准采用下列术语和定义下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T26938-2011牛胚胎生产技术规程。

T/DACS002-2021荷斯坦牛体型鉴定操作技术规范。

术语和定义

供体牛donor

指提供优质卵母细胞的良种母牛。

活体采卵ovumpick-up（OPU）

借助专用兽用超声诊断仪，用阴道探头、采卵针、连接系统和负压泵直接从活体供体牛卵巢上抽吸卵泡液中包含未成熟卵母细胞的操作过程。

卵巢刺激superstimulation

OPU前，通过专用兽用超声诊断仪和外源性激素，诱导供体牛卵巢发育更多卵泡，确保卵母细胞质量和适宜大小卵泡的比例，配合后续不同体外胚胎生产的操作方法。卵巢刺激与超数排卵不同，后者需诱导卵泡成功排卵，前者应尽可能保证卵泡以适宜大小存在于卵巢上并避免过度成熟。

采卵室基本要求

仪器

OPU兽用超声诊断仪：包括显示器、OPU专用阴道探头（128阵元、频率5.5Hz～7.5Hz、适配各型号采卵针）、负压泵（吸引压力0kPa～25kPa、0mmHg～200mmHg），恒温器（操作控温范围为38.5±1℃，适配收集管为50mL离心管）、血糖血酮仪。

场地设施

采卵室要求清洁安静、明亮宽敞、温度需8℃～25℃，配备有水电、置物台及设置有防踢链的六柱栏保定架。

药品耗材

所用药品生产厂家应具备生产资质，试剂批号、编号须清晰，试剂和药物应在保质期内并严格按照使用说明书贮存、取用和配置。

药品。兽用注射用促卵泡素（FSH）、注射用前列腺素F2α、孕酮阴道栓，血糖血酮仪试纸、2%盐酸利多卡因、耦合剂、75%酒精、石蜡油、生理盐水、新洁尔灭等。

耗材。一次性采卵针（18G×24/5或1,2×70mm）、硅胶管（1.2mm×2.4mm）、注射器（10mL，20mL、50mL），长臂手套、乳胶手套、口罩、吸水卫生纸等。

供体牛筛选与饲养管理

选拔适用对象

青年母奶牛和成年母奶牛均可作为候选供体牛群体。选择供体牛时，宜根据牧场育种目标、实际生产需要和基因组测序结果，选择具有产奶量、长寿性、繁殖性能、健康度、适应性和抗逆性等优良遗传学价值的母牛。

生产性能分析

调取牧场DHI检测、生产性能和繁殖、疾病治疗等记录。供体牛应满足下列要求：

健康状况良好，排除遗传性疾病与生殖器官疾病；

年产奶量14t以上，生产寿命高于4胎次；

成年母牛应为2～4胎次、产后天数超过45d、卵巢机能已完全恢复；

青年母牛应为9月龄以上、卵巢状态发育良好并至少有1次完整的发情周期。

线性鉴定

参照T/DACS002-2021鉴定供体牛体型。荷斯坦奶牛共划分5个部位：包括体躯容量（18%）、尻部（10%）、肢蹄（20%）、泌乳系统（42%）和乳用特征（10%），20个线性评分性状和23个缺陷性状。按体型鉴定得分划分为6个等级：优秀（EX，90～100）、很好（VG，85～89）、好+（G+，80～84）、好（G，75～79）、一般（F，65～74）和差（P，65分以下）。应选择等级为“好+”及以上、无明显体型缺陷的母牛作为供体牛。

全基因组选择

全基因组测序应由商业化公司完成。操作人员应穿戴防护、确保血斑卡干净无污染，奶牛耳号、血斑卡号和表格登录号必须保持一致，规范制作测序血液样本血斑卡：

在空白的血斑卡背面标记牛号等信息，用5mL或10mL的一次性无菌注射器，从奶牛尾根部或颈部采集血液样本1mL，立即将血样滴加至血斑卡中心黑色圆圈内，完全覆盖但不能超卡片；

放置桌面自然晾干（约12h）。

供体牛饲养

确认供体牛后，宜单独分群饲养。牧场实施常规管理，日粮配方平衡全面，保持合适体况，环境清洁安静，饲养密度合理，运动适量。应建立和实施完善的防疫、生物安全制度，保证牛群无中毒风险。

卵巢刺激前评估

卵巢刺激程序前1天，应评估供体牛是否适合卵巢刺激和OPU操作。

临床检查。检查供体牛体温、精神状态、采食情况、瘤胃充盈度和粪便等情况，应重点检查是否发生乳房炎、子宫炎、肺炎和腹泻等炎性疾病。

能量平衡状态检查。检查供体牛近1周产奶量、评估近1天采食状况，卵巢刺激前1天，采集血液样本，检测血糖和血β羟基丁酸水平。其中血糖值应为2.8mmol/L～4.5mmol/L，血β羟基丁酸应＜1.2mmol/L。

温顺