荞麦胰蛋白酶抑制剂的固定化及对胰蛋白酶的分离.pdf

中文摘要

胰蛋白酶在各行各业应用广泛，市场需求越来越大，并且对胰蛋白酶的纯度要

求也越来越高。胰蛋白酶的传统制备方法存在耗时长、操作复杂、产量低、产品纯

度低等问题，需要建立一种快速高效的纯化方法。荞麦胰蛋白酶抑制剂（buckwheat

trypsininhibitor,BTI）对胰蛋白酶有较强的特异性亲和力，可用作胰蛋白酶亲和材料

的配体。本研究通过优化载体和配体，制备出四种胰蛋白酶亲和材料：

MCC@BTI-CBD、FeO@PDA@BTI、FeO@PDA@2BTI和FeO@PDA@3BTI。

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制备的亲和材料绿色安全、操作简单、稳定性好，可以有效分离纯化胰蛋白酶，获

得高纯度胰蛋白酶。本研究建立了一种高效纯化胰蛋白酶的新方法，拓宽了蛋白酶

抑制剂的应用研究范围。

1.MCC@BTI-CBDMicrocrystalline

的构建、性质研究及应用。以微晶纤维素（

cellulose，MCC）为载体，BTI-CBD重组蛋白为配体，制备出亲和材料

MCC@BTI-CBD。利用纤维素结合域（Cellulosebindingdomain,CBD）标签对纤维

素的特异性亲和力实现BTI-CBD的一步纯化和固定化。确定最佳固定化条件为质量

3%6hMCC@BTI-CBDpH

体积比为，固定化时间。亲和材料具有良好的、热稳定

性和储存稳定性。重复使用10个循环之后，MCC@BTI-CBD对胰蛋白酶仍然保留

47.33±2.15%的吸附率，重复使用性好。MCC@BTI-CBD具备良好的溶剂耐受性。1

mol/LKCl可以促进MCC@BTI-CBD的抑制活性，而1mol/LNaCl有显著的抑制作

用。100mmol/LMgCl2提高了MCC@BTI-CBD的抑制活性。NiSO4和AlCl3降低了

MCC@BTI-CBD的抑制活性，在100mmol/L浓度下，MCC@BTI-CBD分别保留了

86.55±2.58%和54.10±3.93%的剩余抑制率。亲和材料MCC@BTI-CBD能够实现对猪

胰蛋白酶的一步分离纯化，对猪胰蛋白酶的最大吸附量为3.60±0.16mg酶/g亲和材

料。

2.FeO@PDA@BTI的制备、性质研究及应用。使用Ni2+-NTA和SephadexG-25

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柱纯化脱盐得到BTI纯化蛋白。以BTI为配体，聚多巴胺（Polydopamine，PDA）

包裹的FeO磁性纳米粒子为载体，通过PDA表面的活性基团，实现BTI的共价固

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TEMFTIRVSMPDABTI

定化。、、和粒径分析结果证明修饰成功，固定化成功，

FeO@PDA@BTI具备良好的分散性能和超顺磁性。FeO@PDA@BTI具有良好的

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pH10

稳定性、热稳定性和储存稳定性。在重复使用个循环之后，亲和材料对胰蛋

I

白酶的吸附率仍有45.35±0.19%。浓度为50%的乙醇和DMSO室温处理1h后，

FeO@PDA@BTI的剩余抑制率分别为93.38±2.38%和85.41±1.77%。经8mol/L

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10%SDS1hFeO@PDA@BTI