关于乙酰胆碱酯酶多聚化、胞外分泌、膜锚定和功能性定位的研究.doc

关于乙酰胆碱酯酶多聚化、胞外分泌、膜锚定和功能性定位的研究 【摘要】：本论文主要围绕研究决定乙酰胆碱酯酶(AChE)在细胞膜功能性定位的细胞学机制展开。本论文首先研究了胆碱脂酶(Cholinesterases)的催化结构域和C端肽链对该酶多聚化的影响。脊椎动物拥有2种胆碱脂酶:乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。这两种酶又分为不同亚型,其中T亚型代表了该酶在胆碱脂酶组织中最重要的种类。这项研究构建了胆碱脂酶的突变体,将两种酶的C端肽链进行互换,同时还在该肽链的不同位点引入Cysteine氨基酸的突变。通过瞬时转染和连续离心沉淀技术,发现胆碱脂酶的催化结构和C端肽链两者对该酶的四聚化和胞外分泌过程施加影响。尽管两种PRiMA蛋白拥有不同的C-末端,但它们都能诱导AChE在细胞膜上的锚定。此外,C-末端存在多个转录后修饰位点。这些事实都提示:PRiMA蛋白的C-末端有另外的功能,它可能与细胞内其他的蛋白,尤其是骨架蛋白相互作用。为了探索这个可能性,本论文同时在细菌和酵母系统中,利用PRiMAI蛋白C-末端40个氨基酸肽链作为诱饵,结合人脑的cDNA库进行了蛋白双杂交实验。利用这个技术,筛选了能与PRiMAI蛋白C-末端相互作用的、候选胞内蛋白。本论文还检测乙酰胆碱酯酶被转运到细胞脂质筏中的可能性。通过原位突变技术,把PRiMA蛋白C-末端的磷酸化和棕榈酰化位点特异性地去除,通过与野生型PRiMA蛋白,就乙酰胆碱酯酶脂质筏锚定能力的比较,发现这些转录后修饰不对该锚定作用产生决定性影响。CutA蛋白与细菌内一个参与抗二价阳离子的蛋白高度同源,此外它还在多个哺乳动物的组织中表达,但至今它的功能仍然未知。为了澄清这个问题,本论文研究了该蛋白两个剪接变异体的亚细胞定位。利用原位突变技术,分别在mCutA蛋白质的N端或C端引入抗体结合标记。此外,构建了CutA-AChE融合蛋白。研究发现在CutA蛋白的诱导下,该融合蛋白中的催化基团显示了酶活性,被N-糖基化,并且最终被分泌到胞外。这一结果显示部分CutA蛋白能在其生物合成期间进入了内质网。本论文还对CutA蛋白在促进AChE-T四聚化、胞外分泌和诱导蛋白错误折叠过程中,以直接或间接的方式发挥的作用做了进一步的研究。【关键词】：胆碱酯酶双杂交实验PRiMA脂质筏CutA多聚化细胞膜功能性定位胞外分泌 【学位授予单位】：华东师范大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2009 【分类号】：Q55 【目录】：论文摘要5-6REMERCIEMENTS6-9Generalintroduction9-15Introduction10-14.Thecholinesterases:acetylcholinesteraseandbutyrylcholinesterase10-12Ⅱ.Cholinesterase-associatedstructuralproteins:ColQandPRiMA12-13Ⅲ.TheCutAprotein13-14Objectivesofthisthesis14-15ChapterⅠ:TherolesofthecatalyticdomainandoftheC-terminaltpeptideinoligomerizationofcholinesterases15-51Introduction16-23ArticleⅠ:RespectiverolesofcatalyticdomainandC-terminaltpeptidesintheoligomerizationofacetylcholinesteraseandbutyrylcholinesterase23-48Discussion48-51ChapterⅡ:AsearchofbindingpartnersoftheC-terminalpeptideofPRiMAⅠbytwo-hybridstrategies51-60Introduction52-53Two-hybridsysteminSaccharomycescerevisiae53-54Two-hybridsysteminEscherichiacoli54-56Procedureoflibraryscreeningandanalysis56-57Co-expressionofPRiMAⅠandcandidatepartnersintransfectedCOScells57-59Discussion59-60ChapterⅢ:InsertionofPRiMA-anchoredAChEinmembranerafts:roleofthecytoplasmicdomainsofPRiMAⅠandPRiMAⅡ60-88Introduction61-62ArticleⅡ:Targeting