生化技术：9 高效液相色谱.ppt

1906年，俄国生化学家茨维特第一个运用玻璃柱分离植物色素，并取得较好的分离效果，成为世界公认的液相色谱的奠基人。但受当时技术条件的限制，这种经典的柱色谱由于柱效、回收率、重现性等因素的影响，未能迅速发展 直到20世纪60年代末70年代初，人们将GC色谱的原理引进液相色谱以后，才演变成今天的分离性能好、分离速度快、使用范围广的高效液相色谱（HPLC high performance liquid chromatography ） 4、检测系统 检测器 ----检测由色谱柱洗脱下来的组分，根据其洗脱的先后顺序在色谱图中出峰，以tR表示洗脱的难易程度，以色谱峰的峰面积A表示组分含量（有时用峰高H） 5、数据处理系统 此系统负责对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理 如外标法中，测得对照品和供试品的峰面积，根据对照品溶液的浓度即可计算出样品浓度 五、色谱柱 根据制备方法不同分为填充柱和毛细管柱；其中最常用的是刚质填充柱，其填料即为带有固定相的担体。以微粒硅胶为基质的化学键合相是目前液相色谱法中应用最广泛的固定相。如RP-HPLC中运用最广泛的十八烷基键合硅胶（ODS）即是将一层细的丙烯桥双配位C18硅烷键合到硅胶上，可有效抑制硅胶在高PH条件下溶解，拓宽硅胶的稳定范围（PH2~11.5）。另外，ODS键合烷基C18链较长，对碳载量和溶质的保留值都增高 常用色谱柱的内径为4.6mm柱长15~25 cm（4.6×25） 六、流动相 在RP-HPLC中，流动相为水和有机溶剂组成的混合溶液 流动相的要求 （1）各种有机溶剂尽可能用“色谱纯”或“HPLC用”的溶剂；水最好用超纯水或重蒸馏水；如果流动相含盐，应将配好的流动相经0.4μm 或0.22μm的滤膜过滤后再用 （2）使用前应进行脱气处理，否则分离效果不好，并且易损伤色谱柱 （3）流动相应避免过酸或过碱，一般PH使用范围2.5~7.5；因为以硅胶为基质的键合固定相对酸和碱较敏感 （4）性质稳定,不与固定相发生不可逆的化学反应 （5）与检测器相匹配，对检测不产生干扰 （6）对样品有适当的溶解度；通常以流动相为溶剂溶解供试品制备供试品溶液，这样在色谱图上就没有溶剂峰 （7）沸点低，且不易聚合；这样回收样品较容易 八、与HPLC相关的概念及基本理论 (1) 概念： 1、基线 指只有流动相通过检测器时所得到的信号，通常为一水平直线，是检测色谱仪正常与否的重要指标 2、色谱峰 当有物质混在流动相中一起流经检测器时，所得到的高于基线的峰形 3、流速 指流动相流经色谱柱的速度；通常以ml /min 为单位 4、拖尾峰 出峰时，峰形上升很快，而后缓慢回到基线的峰 5、伸舌峰 出峰时，峰形上升缓慢，而后很快回到基线的峰 6、怪峰/鬼峰 除样品组分以外的色谱峰。这些峰的出现与色谱仪的结构、柱流失、系统污染及样品分解等因素有关 7、保留时间（tR） 样品通过色谱柱所需的时间 8、保留体积（VR） 保留时间与流速的乘积；通常以ml为单位 9、峰宽（W） 峰两侧拐点作切线与峰底相交的两点之间的距离 10、半（高）峰宽（ ） 峰高一半处的峰宽；为了测量方便，通常用半峰宽代替峰宽。（峰宽有时可作为研究柱效的指标，W越窄，峰越尖，则柱效越好） 11、峰的容量因子（K，） 又称分配比、容量比，指某组分在固定相和流动相中的分配量（质量、体积或摩尔）之比；是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。（K，越大，则t R越大，洗脱就困难；反之，K，越小，则t R越小，洗脱就容易） * * * * * * * * 第九章 高效液相色谱 高效液相色谱的简史 第一节 基 本 原 理 1、样品不必气化 2、分离温度低 3、选择性好 4、样品回收容易 5、分离效果好 一、HPLC的特点 据不完全统计，目前全世界已知的天然和合成的化合物有超过500万种以上，其中70~80%化合物可用HPLC分析，而只有20%可用GC分析 如:1.利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离小麦胚乳醇溶蛋白 2.武汉化工学院测试中心:采用高效液相色谱法,在C18柱上,以甲醇—乙酸乙酯(95 ：5,体积分数)为流动相,检测器波长为275 nm,测定了维生素A 醋酸酯,维生素D3和维生素E 醋酸酯的含量 二、 HPLC的分类 1、高效液-固吸附色谱 2、高效液-液分配色谱 3、高效离子交换色谱 4、高效离子对色谱 5、高效排阻色谱 三、HPLC的分离原理 1、高效液-固吸附色谱 根据吸附与解吸附机制。首先，样品组分吸附于固