福林酚蛋白质含量(终)幻灯片.ppt

实验报告要求 1.把实验所得数据如实记录在在实验报告上（表格）给小老师签字记录。 2.按要求绘图（坐标纸或电脑绘图），得出回归方程，并由方程求出未知蛋白质溶液中蛋白质含量 3.误差分析 4.完成思考题 生物化学实验 福林-酚法测定蛋白质含量 12级生化小老师2组 双缩脲法 紫外吸收测定法 福林-酚试剂法 考马斯亮蓝G-250法 蛋白质含量测定四种方法 生物化学实验 实验目的 掌握福林-酚法测定蛋白质含量的原理及操作步骤 进一步熟悉分光光度计的操作 生物化学实验 蛋白质 碱性铜试剂 铜-蛋白质络合物（双缩脲反应） 试剂甲 紫红色 铜-蛋白质络合物 磷钼酸-磷钨酸 磷钼蓝 + 磷钨蓝 试剂乙 蓝色 (福林-酚试剂) 生物化学实验 实验原理 OD 640 值与溶液中的蛋白含量 成正比 以蛋白含量为横坐标， OD640值为 纵坐标，二者之间的关系应为直线。 生物化学实验 比色法的测定原理 蛋白含量(ug) OD640 由未知样品的OD640值，通过标准曲线，由作图法即可知道未知样品的蛋白含量。 未知 实验影响因素： 实验干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰反应。 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。 生物化学实验 试剂 试剂甲A液，试剂甲B液，试剂乙，蒸馏水 材料 标准蛋白质溶液（BSA） 未知蛋白质溶液 仪器 分光光度计，漩涡混合器，试管与试管 架，吸量管与洗耳球等 试剂和仪器 生物化学实验 试剂甲：A 液——10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.5 g 酒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水中。 B液——0.5 g CuSO4?5H2O 溶于100 mL蒸馏水中。 试剂甲即为将两溶液以A:B=50:1的比例混合后所得的混合溶液。(使用前混合） 试剂乙：在2升的磨口回流瓶中加入100 g 钨酸钠（Na2WO4?2H2O），25 g钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）及700 mL蒸馏水，再加入50 mL 85%磷酸，100 mL浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管小火回流约10小时。回流结束后加入174.55 g一水合硫酸锂，50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟一边驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。注意此时溶液的黄色为亮金黄色，如仍有绿色显现，须再重复滴加液体溴的步骤。将所得溶液稀释至1000 mL，过滤后将滤液密封保存在棕色试剂瓶中。 生物化学实验 试剂乙的配置 生物化学实验 Folin-酚试剂的试剂乙配制花费时间长，但可在棕色瓶中低温久藏不变性。在回流过程中可明显观察到其颜色的变化。 开始回流 制得的试剂乙 回流1h 回流7h 回流10h 标准蛋白质（BSA）溶液：取结晶BSA 0.5 g溶于少量蒸馏水中，定容至2 L，浓度为250 μg/mL 。 未知蛋白质溶液：浓度未知的牛血清溶液，稀释100倍。 生物化学实验 使用时用标准氢氧化钠溶液滴定，以酚酞为指示剂， 溶液的颜色由红色变为紫红色、紫灰， 再突然转变为墨绿时，即为终点。 适当稀释（约加1倍水）， 使最终的酸浓度为1 mol/L 试剂乙制取装置 生物化学实验 仪器： 试管9支，分别编号。 吸量管（5 mL,1 mL,1 mL,1 mL, 0.5mL） 贴上标签专管专用 分光光度计 漩涡混合器 720型分光光度计 实验步骤 生物化学实验 按下列顺序加入各试剂 均加入0.5ml，立即混匀，室温放置 30分钟后选择650nm波长光比色 试剂乙 （1 mol/L） 均加入5ml摇匀，室温下放置10分钟 试剂甲 --- 0.5 --- 0.2 0.4 0.6 0.8 0.9 1.0 H2O(ml) 1.0 0.5 --- --- --- --- --- --- --- 待测蛋白（ml） --- --- 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1 0 250 ug/ml BSA (ml) --- --- 250 200 150 100 50 25 0 蛋白质含量（ug） 9 8 7 6 5 4 3 2 1 试管 以1号管为空白对照管，