以Glu、Lys为原料，采用化学合成法生产聚谷氨酸、聚赖氨酸.doc

以Glu、Lys为原料，采用化学合成法生产聚谷氨酸、聚赖氨酸 ?-聚谷氨酸 ?????????-聚谷氨酸（??PGA）是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，其结构为谷氨酸单元通过α-氨基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物由多种杆菌??acillus?species?产生的一种胞外多肽，尤其是某些微生物荚膜的主要成分。 中文名称?：??????聚谷氨酸?、多聚谷氨酸、聚-γ-谷氨酸poly-γ-glutamic acid，简称PGA 聚谷氨酸的结构式： 聚谷氨酸的分子量：γ -PGA的分子量从5万到2百万道尔顿不等。 聚谷氨酸的性质：游离酸型的??聚谷氨酸p??值约为????，与谷氨酸的?羧基的大体一致，能够溶于二甲亚砜、热的?，?一二甲基酰胺和?一甲基吡咯烷酮。金属盐?钠型?的??聚符氨酸的比旋光度约为??????C????，????。??PGA具有水溶性、不含毒性可生物降解性，由微生物发酵法利用胞内??PGA合成酶系催化D?和L?谷氨酸通过??谷氨酰胺键连接而成。这种由杆菌产生的胞外多肽???聚谷氨酸与化学合成的聚谷氨酸在分子结构上有本质的差异，前者的结合键是??酰基，其可以被土壤中的微生物分泌的水解酶所分解。经研究表明，??聚谷氨酸是一种阴离子异形肽，分子量约为??5。分子中的氢键对???聚谷氨酸的高水溶性起着关键作用。 聚谷氨酸的生产方法： ??PGA的生产方法包括：化学合成法、酶转化法、提取法和微生物发酵法。 （?）化学合成法： ?-PGA，为不成环聚合，化学合成法是肽类合成的重要方法，但由于其合成路线复杂、步骤较多、副产物多、收率低（尤其是含20 个氨基酸以上的纯多肽合成）且需要光电等有毒气体，成本高，产率过低；故很大程度上限制了该法的应用。 b、二聚体缩聚法 由L-Glu，D-Glu及消旋体(DL-Glu)反应生成?-甲基谷氨酸，后者凝聚成谷氨酸二聚体后，再和浓缩剂1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳亚二胺盐酸盐及1-羟苯基三吡咯( 1-hydroxy-benzot riazole) 水合物在N，N-二甲基甲酰胺中发生凝聚，获得产率为44% ~ 91%、相对分子质量为5000~ 20000的聚谷氨酸甲基酯，经碱性水解后最终得到γ-PGA。 由于方法的局限性，化学方法合成的?-PGA分子量比较小，若提高产物分子量必将大大降低产率，由此可见，要获得高纯度的、能用作医药材料，特别是作为药物载体的γ-PGA，化学合成法是不可取的，故该法的工业应用价值不大。 但对于γ-PGA结构和功能关系的了解、γ-PGA合成酶反应机制的分析及γ-PGA实际应用修饰技术的发展等具有一定的指导意义。 （2）酶转化法： 提取法： 微生物发酵法： 从聚谷氨酸的发现至今仅有几十年的历史，聚谷氨酸的研究主要还是处于实验室阶段，主要包括对它性质研究，产生菌的改良和基因研究，发酵过程研究和提取提取纯化过程研究，以及衍生物的生产和性质的研究。 例：通过芽孢杆菌的变种生产聚谷氨酸： 1 菌种：枯草芽孢杆菌。 种子培养基：葡萄糖2%(质量分数，下同)，谷氨酸钠1%，蛋白胨0.5%，七水硫酸镁0.5%．磷酸氢二钾0.2%。 发酵培养基：七水硫酸镁0.02%，磷酸氢二钾2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸锰0.003%，谷氨酸钠4%，硫酸氨0.5%，葡萄糖5%。 种子培养条件：32.5℃，搅拌22r/min条件下培养15h，生长过程如图1。 发酵培养条件：接种量1%，通气量为2.4L/min。温度为32.5℃，搅拌速度为400r/min。培养时间酌情而定(主要根据残糖消耗和菌体生长情况)，一般等到残糖为零，且菌体开始衰亡(A660降低)时停止培养，发酵过程如图2。 可以看出产物合成与菌体生长同步．菌体生长从8h开始进入对数生长期，糖消耗比较快。产量最后达到27.33g/L(48h)，仍呈上升趋势，此时底物糖耗尽，但菌体尚未呈衰亡趋势，应适当延长培养时间。 2．分离纯化 通过微生物发酵得到高粘度发酵液．采用有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离沉淀法可获得??聚谷氨酸。 有机溶剂沉淀和化学沉淀是指利用离心或凝聚菌体的方法除去发酵液中的菌体，在上清液中加入低浓度的低级醇?如甲醇、乙醇?，体积为上清液的?～?倍，沉淀得到??聚谷氨酸。然后用水溶解??聚谷氨酸，透析除去小分子，滤液冷冻干燥得到白色晶体，即为产品。 对高粘度的发酵液还可以采用膜分离沉淀法．因为发酵液粘度很高，离心非常困难。将发酵液的p?值调到?～?，粘度随p?值的下降而下降，p???时，发酵液粘度降为原浓度的????p???时，微生物会发生降解，p???时，发酵液粘度会上升?。调节p?值主要是使细胞表面电荷减少，菌体发生凝聚，使离心更有效。如p???时，在????rmin条件下离心??min可有效地把菌体从发