谷氨酸生产菌培训课件(ppt).ppt

（2）选育强化CO2固定反应的突变株 a.选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好的菌株。因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应，该反应与C02固定反应是相同酶所催化，C02固定反应相应地加强。 b.选育氟丙酮酸敏感突变株。 因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，即抑制丙酮酸向乙酰CoA转化，相应地CO2固定反应加强。突变株对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。 c.选育减弱乙醛酸循环的突变株。 乙醛酸循环减弱不仅能使C02固定反应比例增大，而且异柠檬酸也能高效率地转化为α-酮戊二酸，再生成谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型突变株和不分解利用乙酸的突变株。 （3）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性突变株和谷氨酰胺抗性突变株。 草酰乙酸 谷氨酸转氨酶 天冬氨酸+α-酮戊二酸 谷氨酸 α-酮戊二酸NH3 谷氨酸脱氢酶 （4）选育强化能量代谢的突变株 原因：使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成速率加快。 a.选育呼吸链抑制剂抗性突变株 如可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来实现。 b.选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株 如可选育2,4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实现。 c.选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 如可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。 （5）其它遗传标记 选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、抗核苷酸类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、AEC抗性、AHV抗性、棕榈酰谷氨酸等突变株，都可以不同程度地提高谷氨酸产量。 3.选育能提高谷氨酸通透性的菌株 （1）选育生物素缺陷型菌株。 （2）选育油酸缺陷型菌株。 （3）选育甘油缺陷型菌株。 （4）选育温度敏感型突变株 突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为基因所控制的酶在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。 另一个特点是在生物素丰富的培养基上也能分泌出谷氨酸。 (5)其它突变型菌株 抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能增强谷氨酸的通透性。 五）基因工程选育 基因工程育种是指利用基因工程方法对产生菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。 载体系统 ：一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体，尤以质粒为多。 受体系统 ：受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。 供体菌株：供体菌株选择短杆菌属及棒杆菌属的野生菌或变异株。 工具酶：切割供体DNA和载体DNA的工具酶——限制性内切核酸酶有许多种，HindⅢ、Bcl I、Xba I和Xam I效果最好。 载体系统 受体系统 供体菌株 工具酶 谷氨酸产生菌的许多关键酶的基因已被克隆，Ozaki等克隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因，通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌，产量提高了50％。 周盛等从大肠杆菌E.coli k-12中通过PCR克隆出磷酸果糖激酶编码基因(pfkA)，将其连到表达载体，连接构建成重组质粒pKu-1，转化谷氨酸棒杆菌B4，并得到表达；酶活性测定表明pf-kA基因表达活力为128.6±o.86u／g的蛋白。同时，转化子菌株对糖转化率比B4高10.64％，产酸率比B4高17.1％。 五、菌种保藏与复壮 保藏原理：挑选优良品种，抑制微生物的代谢活性，创造休眠环境。 保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便。 保藏后使用前需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。 一）保藏方法 (1) 低温冷冻保藏； (2) 转接培养或斜面传代保藏； (3) 矿物油保藏； (4) 土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。 (1) 低温冷冻保藏 -20℃以下冷冻，使微生物代谢活动停止 分类：普通冷冻保藏(-20℃) 超低温冷冻保藏(-60一-80℃) 冻干保藏 液氮冷冻保藏 特点：简单有效 培养物运输较困难 超低温冷冻保藏(-60--- -80℃) 超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。 一些细菌和真菌菌种可保藏5年而活力不受影响。 冻干保藏 是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。 特点： 冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力。冻干后的菌株可常温保存，便于运输。 必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等。 液氮冷冻保藏 此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干