DB22T 2081-2014 鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光PCR 方法.docx
ICS11.020B41
备案号:42284-2014DB22吉林省地方标准
DB22/T2081—2014
鼠疫耶尔森菌核酸的测定荧光PCR方法
MethodoffluorescencePCRforthedetectionofYersiniapestis
2014-05-04发布2014-06-01实施
吉林省质量技术监督局发布
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DB22/T2081—2014
前言
本标准依据GB/T1.1-2009、GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。
本标准起草单位:吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。
本标准主要起草人:王玮琳、刘阳、孙舒、聂丹丹、陈光宇、刘韬、刘金华、罗雁非、郑旭
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DB22/T2081—2014
鼠疫耶尔森菌核酸的测定荧光PCR法
1范围
本标准规定了鼠疫耶尔森菌核酸的测定荧光PCR法。本标准适用于鼠疫耶尔森菌的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法
3警告
为了保护实验室人员的安全,应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处置,并按GB19489中的有关规定执行。试样制备及核酸提取过程需在生物安全二级及以上实验室内进行。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PCR:聚合酶链反应(Polymerasechainreaction)。DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)。
Taq酶:DNA聚合酶。
FAM:6-羧基-荧光素(一种荧光报告基团)(6-Carboxy-fluorescein)。
TTAMRA(Carboxytetramethylrhodamine)。TE:缓冲液(Tris-ClEDTA)。
Tm值:核酸融解温度(Meltingtempreture)。
Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(Cyclethreshold)。
5原理
实时荧光PCR方法,是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累,实时监测整个PCR进程,最后通过荧光信号的增幅情况来判定反应结果。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性荧光探针,探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团,PCR扩增时,利用Taq酶的水解作用,使探针上的荧光报告基团远离淬灭基团而发出荧光信号,荧光检测系统可接收到荧光信号,此方法检测的是积累荧光。TAMRA探针(Carboxytetramethylrhodamine,羧基四甲基罗丹明),是罗丹明类荧光素衍生物,TAMRA易于被mercuryarclamps的546nm光谱线所激发,且比荧光素具有更好的光稳定性和敏感性。
6试剂与材料
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DB22/T2081—2014
6.1所用水应符合GB/T6682中的规定。
6.2除特别说明以外,所用试剂均为分析纯或生化试剂。
6.3引物及探针
上游引物5-GTTAATACCAAATATATCCCTGA-3,
下游引物5-TCTGCGTCATAAAGCATTC-3,
探针FAM–TGCAGCCTCCACCGGGATGC-TAMRA
6.410%SDS
在900ml水中溶解100g电泳级SDS,加热至68℃助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分装备用。
6.520mg/ml蛋白酶K
将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml,然后分装成小份贮存于-20℃。
6.6CTAB/NaCl溶液
在80mL水中溶解4.1gNaCl,缓慢加入10gCTAB,同时加热并搅拌,如果需要,可加热至65℃使其溶解,定容终体积至100mL。
6.710×TE缓冲液(pH8.0)
量取1mol/LTris-HCl(pH8.0)25mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)1mL,置于100mL烧杯中。向烧杯中加入约40mL的去离子水,混合