DB22T 2051-2014 饲料中肉毒梭菌测定 PCR 方法 .docx
ICS07.100.30B20
备案号：41839-2014
吉林
省
地
DB22
方标准
DB22/T2051—2014
饲料中肉毒梭菌测定PCR方法
DeterminationofClostridiumbotulinuminfeedstuffsPCRmethod
2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布
DB22/T2051—2014
前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。
本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国顺德出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邵秋荣、刘斌、周亮、刘晓晖、王潇、任明月。
T
DB22/T2051—2014
饲料中肉毒梭菌测定PCR方法
1范围
本标准规定了饲料中肉毒梭菌的PCR检验方法。
本标准适用于饲料中A、B、E、F型肉毒梭菌的快速筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
肉毒梭菌clostridiumbotulinum
肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。
4原理
样品增菌后，培养物经DNA提取制备PCR模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否有特征条带，从而对饲料中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。
5试剂
除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
5.1引物：见表1。
2
DB22/T2051—2014
表1引物序列
目标菌类型
引物序列
扩增长度bp
A型
上游引物：5-GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG-3”
983
下游引物：5-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3”
B型
上游引物：5-GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG-3”
492
下游引物：5-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3’
E型
上游引物：5-CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3’
410
下游引物：5-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3”
F型
上游引物：5-GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGTGCT-3”
1137
下游引物：5’-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3’
5.2疱肉培养基：见附录A.1章。
5.3胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤(TPGY):见附录A.2章。
5.4厌氧卵黄琼脂：见附录A.3章。
5.5细菌基因组DNA提取纯化试剂盒。
5.6TaqDNA聚合酶。
5.7dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,脱氧腺苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosinatriphosphate,脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脱氧胸苷三磷酸)。
5.8溶菌酶。
5.9蛋白酶K。
5.10无水乙醇。
5.11十二烷基硫酸钠(SDS)。
5.12蔗糖。
5.13三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
5.14乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na?2H?O)。
5.1510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化钾(KCl),15mmol/L氯
化镁(MgCl?)。
5.16分子量标记：100bp~3000bpDNAMarker。
5.17琼脂糖：电泳