GB/T 27540-2011猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 k_ __ B41 G 目 中华人民共和国国彖标准 GB/T 27540—2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of classical swine fever virus 2011-11-21 发布 2012-03-01 实施 GB/T 27540—2011 ■ i r ■ ■ i 刖 吕 本标准按 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。 本标准起草单位：中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人:王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。 T GB/T 27540—2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核 酸的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文 件 。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CSFV :猪瘟病毒(Classical swine fever virus) Cl值:达到阈值的循环数(cycle threshold) DEPC :焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) HS Taq 酶：热启动 Taq DNA 聚合酶(HS Taq DNA polymerase) RNA：核糖核酸(ribonucleic acid) 荧光 RT-PCR :荧光逆转录聚合酶链式反应 (real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) 4试剂和材料 除另有说明，所用试剂均为分析纯;所有试剂均用无RNA酶的容器分装。 4. 1 Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4 °C〜8 °C保存。 4.2氯仿：4 °C预冷。 4. 3异丙醇：4 °C预冷。 4.4 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制 ，一20 °C预冷。 4.5 DEPC水：去离子水中加入0. 1%DEPC,37 °C作用1 h,(121±2)°C,高压灭菌15 min。 4.6 RNA 酶抑制剂(30 U/mL) o 4. 7 10X PCR buffer (10 mmol/L pH 3Tris-HCl,50 mmol/L KC1,1. 5 mmol/L MgCl2) 0 4. 8 dNTP(2. 5 mmol/L)