GB/T 27981-2011牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法.pdf

ICS 11．220 B 41 瘩臼 中华人民共和国国家标准 GB／T 27981～2011 牛传染性鼻气管炎病毒实时 201 1-12-30发布 荧光PCR检测方法 Real—time PCR method for the detection of infectious bovine rhinotracheitis virus 2012-06-01实施 宰瞀徽紫瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1” 刖昌GB／T27981—2011本标准按照GB／T．1—20 9给出的规则起草。参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册}(2008版)关于牛传染性鼻气管炎／牛传染性化脓性外阴阴道炎(Chapter4．13)的内容。由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC81)归口。起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。主要起草人：陈茹、刘中勇、林志雄、罗琼、曾碧健、许如苏、姜焱，吴晓薇。 标准分享网 免费下载 1范围牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法GB／T27981—2011本标准规定了牛传染性鼻气管炎病毒(牛疱疹病毒I型，BoHV一1)实时荧光PCR检测方法的技术要求。适用于快速检测牛血样、拭子、精液、动物组织(粘膜、肝、脾，肾、淋巴结、胎盘组织等)和细胞培养物等样品中BoHV-1病毒感染。规范性引用文件下列文件对 本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注B期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适甩于本文件。6682分析实验室用水规格和试验方法世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2008版)关于检测牛冷冻精液中BoHV-1病毒的实时荧光PCR方法3缩略语缩略语适用于本文件。BoHV-I：bovineherpesvirustypel，牛痘疹病毒I型。ct值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA：deoxyr bonucleicacid，脱氧核糖核酸。TT DL-dithiothreitol，二硫苏糖醇。EDTA ethylenediamin tet aacetic乙二胺四乙IBR bo neinfectiousrh no rach itis，牛传染性鼻气管炎。P S ph sphatbu f rs lu i ，磷酸盐缓冲生理盐水C p l mer sha 聚合酶链式反应。S di md ylfa e，十二烷基磺酸钠。U G酶 urac lgly syl ，尿嘧啶DNA糖基化酶。4设备和器材．1荧光PCR仪。台式冷冻离心机。3可调微量移液器：规格10严L、100pL、 00m 。4带滤芯微量吸头：规格lo, L、5R 学反应管6 离心管。7涡旋混匀恒温培养箱9冰箱：规格2℃～8℃ --20℃，--80℃。 标准分享网 免费下载 GB／T27981—20114．10恒温水浴箱。5试剂除另有规定，本方法试验用水应按照GB／T6682中 的二级水，所 化学试剂均为分析纯。引物与探针引物与探针配制采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100btmol／L储存液，置--20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10Fmol／L工作液，避免多次冻融。序列：g 基因上游引物gB-F：5’TGTGACCTAAC3’ 下 R GTATG ：5’[FAM]一 CCGCG TTc TGCE HQl]3’探针5’端标记的报告荧光基团及3’端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。蛋白酶K溶液：配制方法见附录 。3柠檬酸钠缓冲液 配制方法见附录A。40 5mol／LDTA：配制方法见附录A。0 LpH7．2P S：配制方法见附录A。60％chelex7lD×定量PCR—UDG酶预混液：含60U／mL热启动Taq酶，40Tr碡HC (pH8．4)，00 lK I，6Mg z，400d P，400o P 4 ／zmol／L8 zmol／LU mLG。可采用经验证可靠的商品化预混液9核酸抽提试剂盒。无DNA酶、无RNA酶水。1 水乙醇。17 乙醇：用新开启的无水乙醇和无DN 酶、无RNA酶水配制，一20℃预冷。3三氯甲烷4异丙醇。样品采集与处理样品采集及前处理．1 样工具采样工具需经(121±2)℃／0．1Pa高压15in并烘干，或经 60℃干烤2h灭菌。2血清、全血用无菌注射器或 血专用真空管针 菌自牛静脉采血，无菌分离血清，直接用于核酸提取。将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动 充分混合。抗凝剂采 柠檬酸钠缓冲液，或0．5每6L血液加1抗凝剂。直接用于核 取。3拭子棉拭子采集鼻道、生殖器官和眼分泌物， 集时，将拭子反复刮擦呼吸道或生殖器官粘膜，蘸 标准分享网 免费下载 GB／T279