5 第五章 沉淀反应.ppt

沉淀反应 （precipitation reaction) 医学检验教研室 可溶性抗原+相应抗体→肉眼可见的沉淀 三、发展史： 1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血 清混合出现沉淀 1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于其 中，发现沉淀反应可在凝胶中进行 1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术 1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性免疫 试验向定量化发展 1959年 Schultze建立透射比浊法 1967年 Ritchie建立散射比浊法 1977年 Sternberg建立速率散射比浊法 发展趋势：快速、微量、自动化。 原理： 一、单相琼脂扩散试验 (一) 原理 二、双向琼脂扩散试验 (一) 原理： (二) 操作步骤 　　　　制板 1.5%琼脂、4ml／每片 　　　　打孔 孔径3mm，孔间距3~5mm 　　　　加样 　　　　孵育 37℃、24-48h 第二节 免疫电泳技术(immunoelectrophoresis technique) 1.高特异性； 2.高分辨率、快速、微量。 (一) 原理 在pH8.6的琼脂凝胶中： 　抗体球蛋白：带少量负电荷且分子较大，因此电泳力＜电渗力，泳向负极，放(+)； 　抗原蛋白质：带较强负电荷且分子较小，因此电泳力＞电渗力，泳向正极，放(－)； 　电泳一定时间后，二者相向运动，形成肉眼可见的沉淀线。 (三) 方法评价 简便、快速； 敏感度较双相琼脂扩散试验高8~10倍， 但分辨力较其低； 　可测出ug/ml级的蛋白质； 　目前已不推荐使用。 二、火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis,RIE) 单向免疫扩散 + 电泳技术 （四）方法评价： 与单扩比较： 敏感 较单扩散敏感10-16倍（达ug/ml以上） ； 快速 仅需1h左右。 但敏感度仍不高, 方法繁琐, 影响因素较多。 用途 适用快速诊断检测。如乙型肝炎抗原的快速检测。 三、免疫电泳(immunoelectrophoresis,IEP) (一) 原理 （三）方法评价： 　1.为定性实验； 　2.扩散时间长，沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响，结果较难分析； 　3.免疫电泳分辨率高，可分出人血清中20~30种抗原成分，可鉴定混合抗原中各组分。 四、免疫固定电泳 (immunofixation electrophoresis,IFE) 将血清蛋白在载体上电泳分离后，将抗血清直接加于其表面，，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中。 （三）评价： 1.分辩力强、敏感度高、快速仅需数小 时，结果易分析； 2.主要用于M蛋白的鉴定与分型。 第三节 液相内沉淀试验 一、絮状沉淀试验 二、环状沉淀试验 海德堡进行的沉淀分析 　1、在抗体浓度过量时，随着抗原浓度不断上升免疫沉淀逐渐增多　（如右图） 　1.抗原抗体比例： 　　　抗体过量；抗原过量监测 　2.抗体的质量： 　　　1)特异性高:单价特异性抗体 2)亲和力好:速率比浊法中最为重要 3)效价高 :过低(1:20)会增加非特异性浊度. 4)R 型血清:亲和力强 3.增浊剂的使用：（提高反应速度） 　PEG6000，tween-20 注:PEG浓度过高,分子量大,引起非特异性沉淀. 4. 抗原抗体反应的溶液: 最适pH:6.5-8.5 离子强度:磷酸盐缓冲液 5.伪浊度: 标本:高血脂、反复冻融、混浊、污染标本 　　抗体：效价低、特异性差 　　PEG浓度过高： 　　器材不清洁： 反应条件：缓冲液、pH 、温度 6.入射光光源和波长： 　　氦氖光源，633nm 7.标准曲线制备与质量控制 一）透射比浊法 试剂（伊利康） （1）Apo缓冲液（RⅠ）：含4%PEG6000和表面活性剂 （2）羊抗人ApoAⅠ抗体液（RⅡ）：监用前取抗血清200μl，加0.9%NaCl液700μl，混匀，待用，置冰箱一周内有效。 （3）ApoAⅠ参考血清（RⅢ）： 操作： （1） Apo抗体液制备：ApoAⅠ抗血清液100μl + 相应的Apo缓冲液0.9ml 。最好临用前配制当天用量。 （2）定标：按五点梯度稀释定值血清 操作： （4）温育： （5）检测： 操作： （6） 绘制