《植物生理生化》实验指导.doc

《植物生理生化》实验指导 （适用专业：农学类相关专业） 黑龙江八一农垦大学植物科技学院生理生化教研室 目 录 生物化学实验部分： 实验一、氨基酸的纸层析 …………………………………………………………… 1 实验二、蛋白质含量测定C含量的测定……………………………………………………… 12 实验五、还原糖和总糖的测定……………………………………………………… 14 实验六、淀粉酶活性的测定………………………………………………………… 17 实验七、脂肪浸提——索氏脂肪浸提法…………………………………………… 20 实验八、一种简单实用的提取植物DNA的方法…………………………………… 22 实验九、聚丙烯酰胺电泳法测定大麦、小麦种子纯度 ………………………… 24 实验十、淀粉酶的诱导、提取和活性测定（综合性实验）………………………… 26 植物生理学实验部分: 实验一、植物组织水势的测定（小液流法）…………………………………… 28 实验二、植物伤流量的测定………………………………………………………… 30 实验三、根系活力的测定…………………………………………………………… 31 实验四、蒸腾强度的测定…………………………………………………………… 35 实验五、叶绿体色素的提取、分离、性质和测定 实验七、呼吸强度的测定………………………………………………………… 41 实验八、植物抗逆性的鉴定（电导仪法）………………………………………… 43 实验九、植物缺水程度的测定（脯氨酸法）……………………………………… 45 生物化学实验部分 实验一 氨基酸的纸层析 一、目的： 层析分析法已广泛用于氨基酸、核酸、激素、维生素、糖类的分离与分析。其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质；设备简单，操作容易，样品用量很少，结果也较明确。 本实验的目的在于要求学生掌握纸层析法的一般原理和操作技术。 二、原理： 纸层析法是以滤纸作为支持物的分配层析法。分配层析法是利用物质在两种不同混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的。通常用α表示分配系数。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数。 层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维素对水有较强的亲和力（纸上有很多-OH 基与水以氢键相连），吸附很多水分子，一般达滤纸重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），因此使这一部分水扩散作用降低形成静止相；而有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可以在滤纸的毛细管中自由流动，便形成流动相。层析时，将滤纸一端浸入层析溶剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配的数量也就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移动的速度快；而分配系数大的溶质在静止相中分配的数量多，移动的速度慢。所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。 移动速度一般用移动速率表示Rf 表示： 各种化合物在恒定条件下，经层析后都有其一定的Rf值，也就是说在层析谱中有一定的位置。借此可以达到分离、定性、鉴别的目的。 Rf值决定于很多的因素，其中最主要的是所分离物质的分配系数。物质的分配系数是由以下因素决定的： （1）物质极性的大小。水的极性很强，一般极性强的物质就容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。例如侧链含-OH和-NH2、-COOH较多的氨基酸分配在水相中，Rf值较小，而含非极性（如-CH3 ）较多的物质其分子的极性降低，Rf值增大。 （2）滤纸的质地以及为水分饱和的程度。滤纸的质地必须均一、纯净、厚薄适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。 （3）溶剂的纯度、pH值和含水量。pH值和含水量的改变可使氨基酸和层析溶剂极性改变，Rf值也随之改变。 （4）层析的温度和时间。温度改变使溶剂中有机相含水量改变，Rf值也改变。当所有条件相同时，层析时间短，测Rf值的因素必须严格控制。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、 实验材料：在25℃温箱中萌发2-3天的绿豆芽。 2、 仪器：（1） 恒温水浴一台；（2）烘箱一个；（3）研钵一个；（4）三角瓶一个 ；（5） 蒸发皿一个；（6）50毫升分液漏斗一个；（7）量筒三个；（8） 微量吸管（或标有刻度的毛细管）；（9）电热吹风机一个；（10） 层析缸及培养皿；（11）层析滤纸；（12）小型喷雾器一个；（13）剪刀、刀片、铅笔、尺子、玻棒、