第14章核酸的物理化学性质.ppt

一、核酸的水解 酸、碱、酶水解 作用于磷酸二酯键和糖苷键 DNA/RNA对酸/碱的耐受程度有差别 二、核酸的酸碱性质 具有芳香环结构特点 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 ______主要是环内氨基的贡献 DNA等电点为4～4.5； RNA等电点为2～2.5 三、核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键 最大吸收峰260nm左右 四、核酸的变性、复性与杂交 (一) 核酸的变性（denaturation） 1、DNA的变性： 在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 完全变性后核酸紫外吸收值增加： 天然DNA 25－40%、RNA 约1.1% 实质：碱基暴露 DNA变性 5、DNA热变性的特征 变性过程是“跃变式”的，而非渐变 (二)核酸的复性（renaturation） 变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双链——复性。 DNA复性 分子量越大复性越难； 浓度越大，复性越容易； DNA复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列DNA，复性快）。 减色效应（低色效应） —— 第14章 核酸物理化学性质 1、碱基的解离 胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中 鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上 2、核苷的解离 戊糖可增强碱基的酸性解离 核糖中的羟基也可发生解离 3.核苷酸的解离 磷酸基使核苷酸具有很强的酸性 核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。 ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径 OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，降低 3.判断DNA是否变性 某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变 2、变性的实质 降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 高温（一般＞75℃）— 热变性 强酸、碱 — 酸碱变性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAGE中DNA ） 3、变性因素 OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 4、变性后理化性质变化 RNA变性：从螺旋到线团之间的转变 RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显 由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称增色效应 解链曲线：连续加热DNA，以温度对A260作图，所得的曲线称为解链曲线。 指增色效应达50%时的温度 一般DNA Tm 值在85 - 90 ?C之间 Tm：DNA变性时，OD260达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度(Tm)。 大小与G+C含量成正比。 （1）DNA的均一性： （2）G－C含量： 经验公式： XG+C＝（Tm－69.3）×2.44 （3）介质中的离子强度： Tm值大小与下列因素有关： 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 复性时紫外吸收减少的现象