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石河子大学

分子生物学实验结课论文

绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析

学生姓名

学号

专业

年级、班级

指导教师

所在学院

中国·新疆·石河子

2016年1月

绿色荧光蛋白（GFP)原核表达分析

绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析

摘要：本实验主要探讨目的蛋白(GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形

成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其

不同时间点的诱导，用SDS来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP诱导不同

时间的表达情况的检测方法。

关键词：绿色荧光蛋白；SDS—PAGE;原核表达

1前言

1.1实验目的

掌握聚合酶链式反应（PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法;

锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用

研究方法的认知。

1.2实验背景

绿色荧光蛋白（greenfluorescentproteinGFP)是源于多管水母属等海洋无脊

椎动物的发光蛋白,其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光,可以作为报告基

因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT等报告基因

相比，有很多无可比拟的优越性:GFP不具有种属依赖性,在多种原核和真核生物

细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高;不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝

光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；另外GFP分子量小,易于融

合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；并且通过替换一些特殊氨

基酸，可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要.正是由于GFP检测

具有高灵敏度,操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达

与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞

的分离与纯化等研究领域.绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物

质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用.采用GFP作为标记基因，可直

接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体

标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段.同时也正因

为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿

色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假

相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表

达GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进

行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重

要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。

原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质

的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及

哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种

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绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析

特性的质粒可供选择.但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷

酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象.包涵体

是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚

在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过

SDS—PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。

1.3流程图:

2材料与方法

2.1材料

2.1.1实验材料

质粒DNA;PCR产物、酶切质粒、DNAMarker；外源DNA片段：PCR扩增

回收目的片段A和PGM-Tvector（Amp’,lacZ）,带限制性内切酶末端的DNA溶