第12章--体外试验和生物新技术在毒理学中的应用.ppt

* 现在国内外已建立了十多种转基因突变检测模型。与经典的Ames试验比较，转基因动物突变测试体系有许多优点，它是在活体内测试，可动态观察突变率，且在小剂量范围内进行，结果可靠；可测定包括生殖细胞在内的器官或组织的突变率和突变类型。 但由于用转基因动物进行突变测试研究的时间不长，积累的实验资料少，要成为常规的突变筛选方法尚需许多工作要做。需建立一套标准的操作规程，还需建立可测试大片段DNA损伤的测试体系，并尽可能降低费用以利于推广。为了降低靶基因的自发突变率，亟待设计更好的靶基因，从而提高转基因动物突变测试体系的敏感性。 * 2. 致癌检测的模型 利用该类模型可了解基因的改变与肿瘤的关系，进而了解外来物质的致癌作用机理。利用转基因动物将是此种研究的一个有力工具，且业已应用于实际的环境化学物的致癌物评价。 研究发现，药物和化学物质对Lac I转基因小鼠模型的致突变力和致癌力之间存在良好的相关性。通过定量分析一些已知致癌物的微核试验和染色体畸变试验与啮齿类动物长期致癌试验的资料，发现给予50倍TD50的总剂量可使LacI的突变率加倍，LacI转基因小鼠暴露于致癌物250天，其检测的灵敏度与长期致癌试验近似。 * 利用基因打靶技术制备转基因小鼠，已成为研究抑癌基因(如p53基因、Rb基因)在肿瘤形成过程中所起作用的重要手段。 DNA损伤修复能力是肿瘤易感性的重要因素。为了阐明在自发性和化学致癌过程中DNA损伤修复的保护作用，国外已培育出了表达DNA损伤修复基因(如烷基转移酶)的转基因小鼠。 * 3. 转基因动物应用于毒理学研究的特点 (1) 可根据需要导入目的基因：毒理学研究的目的之一就是要揭示毒物危害的本质，我们可以筛选对毒物敏感的目的基因，在分子水平上研究毒物的危害。 (2) 敏感性高：因为导入的外源基因对遗传损伤敏感性高，导入动物体内后其敏感性仍高，可在低剂量下检测，特别适宜于观察慢性低水平接触时的DNA损伤。 * (3) 结果真实可靠：因为转基因动物是一完整生命体系，繁殖多代后仍能带有目的基因，某些特性与人类接近，这就从根本上优于以前的体外检测系统，所得到的结果具有很高的真实性。 (4) 可回收导入的基因：可从动物基因组中回收导入的基因以进行突变的精细研究，如测序、测定突变谱等。 (5) 节省实验开支：传统致癌试验一般需一年以上，以带有某种致癌基因的转基因动物致癌试验3个月左右就能完成，而且比较敏感，因此可节省人力物力。随着科研用途转基因动物的商品化，这一检测体系必将日益推广。 * 五、基因芯片技术 (一) 基因芯片技术基本原理及其制作 基因芯片(gene chip)，又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对的原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作比较和检测，从而迅速得出所需要的信息，分析出待测样品DNA序列。生物芯片(biochip)还包括正在研制的蛋白质或肽芯片、组织原位芯片等类型。 * 基因芯片利用核酸杂交原理检测未知分子。它是由核酸片段以预先设计的排列方式固定在载玻片或尼龙膜上而组成的密集的分子排列。 其技术制作主要有二种方式：一种方式是在固定面上按设计方式固定不同的靶分子(DNA或RNA)与游离的探针杂交。另一种方式是在固定面上化学合成一系列寡核苷酸探针与游离的靶分子杂交。 杂交信号的检测是根据杂交分子或未杂交分子所发出的不同波长的光实现的。荧光信号是由激发探针或靶分子上的荧光素放出的荧光信号被检测器及处理器处理从而得知分子杂交情况。检测器及处理器由激光共聚焦显微镜及电脑组成。 * (二) 基因芯片技术的应用 1998年底美国科学促进会将基因芯片技术列为该年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。现在，基因芯片已被迅速应用到生物科学众多的领域之中，它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出极大的魅力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。 * 基因芯片技术是一种高效准确的DNA序列分析技术，将基因芯片应用于检测基因突变，不仅可以准确地确定突变位点和突变类型，更主要的是它的快速高效而为目前应用的直接测序法所无法比拟，它可以同时检测多个基因乃至整个基因组的所有突变，是对基因突变检测技术的一次重大突破。 基因芯片也可