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超滤管使用方法和注意事项

蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管,常用Millipore的Amicon-Ultra-15

超滤管〔MWCO10kD〕.也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选,视目

的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定.可重复使用,使用一次就扔掉

太浪费.以下是个人总结的使用方法和注意事项.

1、选择合适的超滤管,主要考虑MWCO和浓缩体积,最常见的是Ultra-15〔10kD〕.

到底选择多大截留分子量比较合适呢？10kDa、5kDa、还是30kDa？通常应截留

分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量为35kDa,就可以选

择10kDa截留分子量的超滤管.若目的蛋白分子量为10kD左右,则可以用截留分

子量3kD的超滤管.认真阅读使用说明书,注意超滤膜对各种化学物质的耐受程

度有所不同,表格中有.

2、新买来的超滤是干燥的,使用前加入MilliQ水,水量完全过膜,冰浴或冰箱里

预冷几分钟.然后将水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超过管顶的白线

为准.操作要轻,加入蛋白液前,超滤管需要插在冰上预冷.

3、平衡.质量和重心二者都要达到平衡.注意转速和加速度不可太快,否则直接损

坏超滤膜.开始离心超滤〔离心机预冷至4度〕.不同离心机的转速rpm换算成g

之后,有所不同.具体可参阅附件里的说明书.离心机的加速度调至最低档,减小

对膜的压力.注意,一定要等离心机达到目的转速之后,方可离开离心机,否则离

心机出问题时,无法第一时间处理,后果不可预测！膜与转轴的方向根据说明书调

整〔角转离心机的情况是膜与轴垂直〕.在实际使用中,一般转速开的比说明书

里的要低,这样可以延长离心管的使用寿命.

4、当浓缩到剩下1ml时,[取50ul国产Bradford溶液,加入10ul流穿,看有没变

蓝色,以此判断超滤管是否漏掉蛋白.如果管漏了,将上层和流穿重新倒入新管

中开始超滤.要精确判断是否漏管,用5mg/ml的BSA离心10min,再取流穿,跑蛋

白胶或Bradford粗测],继续加入剩下的蛋白液浓缩〔在冰上操作,防止蛋白受

热〕,直到所有浓缩液都加完为止.离心过程中注意是否发生蛋白沉淀,导致堵管.

若发生沉淀,要确定沉淀的具体原因,是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者

可用多根超滤管同时超滤,降低浓度的办法解决,后者的方法是换不同的Buffer,

直到蛋白不发生沉淀为止.

5、前面几步用以浓缩蛋白,如果要换Buffer,在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候,

轻轻加入新的Buffer〔经0.22um超滤膜超滤〕,再浓缩至1ml左右,连续三次,

最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定,一般不多于500ul,也有浓缩

至200ul以内的情况.按照每次至少10倍左右的体积浓缩算,三次达到1000倍

以上,基本上可以达到换buffer的目的.

6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作,用黄枪头〔200ul〕取,轻轻顺着边缘

插入枪头,轻轻吹打、混匀蛋白液,注意不要碰到超滤膜,然后吸取浓缩液,每次

吸接近200ul,直到吸完.管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取,否则难度太大,

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有可能损坏超滤膜.最后加入MilliQ水到超滤管中,没过超滤膜,防止膜失水变

干.

7、以下是处理超滤管,重复利用超滤管的步骤.

8、倒出超滤管里的水,用milliQ水轻轻润洗几次,[若管底有可见的蛋白沉淀,

可以先加入水,然后用枪头吹打,注意不要碰到膜,吹打至沉淀悬起,然后倒掉,

不可用自来水猛冲]然后加入0.2M的NaOH溶液,室温放置20min,期间平衡超滤

管.再离心10min.倒出残留的NaOH溶液,将管芯浸入MilliQ水的烧杯1或2L

中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时,不断稀释NaOH浓度.50ml管和盖

子用自来水洗,内壁再用MilliQ水洗干净.

9、取出浸没的管芯,加至接近满的MilliQ水,50ml管也加满MilliQ水,将管芯

慢慢放入50ml离心管,排出部