第二章石蜡制片方法–1.ppt

* * 固定液的种类和常用固定液的配方 固定液的种类 分为两大类：简单固定液和混合固定液。 1.简单固定液又称单纯固定液 就是用一种化学试剂作为固定液。种类有：乙醇、福尔马林、醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、升汞和锇酸等八种。 2.混合固定液 就是用几种化学药品，按一定的比例混合配制而成的，由于各种药品的优缺点互相弥补，因此可产生较好的效果。 常用固定液的配方 （1）福尔马林[Formalin，37—40％的甲醛(HCHO)] 适合固定的浓度：10％福尔马林(3.7—4％甲醛) （2）卡诺氏液(Carnoys Fluid) 适用范围：适用于胚胎学、细胞学研究。 配方： (1) 纯酒精 3份 冰醋酸 1份 (2) 纯酒精 6份 冰醋酸 1份 氯 仿 3份 卡诺氏液的处理方法和特点 处理：固定时间为12—24小时，有的也可缩短.例如根尖可固定15分钟，花药固定1小时，子房可固定12—24小时。固定完毕可用95％或纯酒精洗涤，换二次，经二甲苯与纯酒精等量混合液过渡，二甲苯透明两次，就可进入石蜡中浸蜡。如果不立即制片时，可转入70%酒精中保存。 特点：这两种固定液穿透力既强又快，纯酒精固定细胞质，冰醋酸固定染色质，并能防止组织由酒精引起的高度收缩与硬化。 （3）福尔马林——醋酸——酒精混合液(FAA) 适用范围：适用于除单细胞及丝状藻类以外的植物组织，但不适于作细胞学研究。 配方： 50％或70％酒精 90毫升 冰醋酸 5毫升 福尔马林 5毫升 处理：(1)一般柔软材料，特别是苔藓植物，可用低度(50％)酒精。(2)固定时间最短需18小时，也可无限期延长，木质小枝至少须固定一周.(3)冲洗时材料可直接换入50％或70％酒精中洗一、二次，木质材料在流水中冲洗48小时，并在酒精(50％)和甘油溶液(1：1)中浸2、3天，使它软化。 （4）纳瓦兴氏液(Navaschin’s Fluid) 适用范围：植物组织及细胞学的研究 配方： 甲液： 10％铬酸 15毫升 冰醋酸 10毫升 蒸馏水 75毫升 乙液： 福尔马林 40毫升 蒸馏水 60毫升 在使用之前，才将甲、乙两液等量混合。材料经固定之后可在此液中长期保存。 处理：固定时间为24-48小时，固定后可直接在蒸馏水中洗几次，再继续脱水。 冲洗 目的 材料自固定液中取出后，须立即冲洗，使其中含有的固定液全部除去，—直到洗净为止，否则防碍染色和保存。 冲洗液的选择 冲洗液应依固定液的性质而定，一般水溶性的固定剂用水来冲洗，酒精溶性的固定剂用相同浓度的酒精冲洗。 冲洗的方法 水冲洗法 酒精洗涤法 脱水 脱水的目的 使组织中的水分完全除去，并使组织变硬。各种材料经固定与冲洗后，组织中就含有大量水分，不能直接投入石蜡中包埋。因为水和石蜡是不能溶合的，一定要经过脱水剂将水分脱净，透明剂透明后，才能进入包埋阶段。如脱水不干净，就会影响制片效果，甚至完全失败。 脱水剂及其脱水方法 脱水剂 最常用的脱水剂为酒精。此外还有丙酮、正丁醇和叔丁醇等。 脱水方法 1.配制下列各级浓度的酒精： 15％，35％，50％，70％，85％，95％，100％。 2.一般经水洗的材料，脱水可自35％开始，柔弱的材料自15％开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50％或70％酒精中继续脱水。 3.在每级度中停留的时间，依材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。一股的标准是： (1)如洋葱、蚕豆等根尖和小片叶子一样大小的材料，每级停留约30分钟到1小时。若用苦味酸固定则可延长为1小时。 (2)由FAA固定的草本茎，每级停留2小时，木本茎停4小时，较大的木材每级应延长为8—12小时。 (3)脱水至纯酒精时，需更换二次，每次30分钟到1小时；材料大者，可多换一次。由95％换100％酒精时，瓶子上的塞子也应更换干燥的，以免有水分渗入。 (4)已制成的切片，在染色缸中脱水时，每级停留时间约为3—10分钟。 (5)脱水时应按顺序进行，级度不宜相差太大，一般应按第1项所配各级浓度进行