二元手性选择体系毛细管电泳分离检测未衍生化氨基酸对映体的研究.doc

二元手性选择体系毛细管电泳分离检测未衍生化氨基酸对映体的研究 陈裕富 谢天尧 （中山大学 化学与化学工程学院，广州 510275） 摘要 以铜-L-赖氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC）构成二元手性选择体系，在熔融石英毛细管（50μm i.d.×50 cm）中，用毛细管区带电泳－电导法成功对未衍生化苯丙氨酸对映体（D,L-Phe）进行分离。在选定体系下：1.0mmol/L NaOH+ 0.4 mmol/L Cit+ 1.0 mmol/L Cu(Ac)2+2.0 mmol/L L-Lys +20mg/L HPMC，苯丙氨酸对映体获得良好的基线分离。其线性范围为10～200 mg/L，检出限（S/N=3）为3 mg/L。对影响分离度的影响因素：电泳运行液组成和浓度、配体选择剂摩尔比和浓度、HPMC的浓度等进行了详细的讨论。本实验高效简便、分析成本低。 关键词 毛细管电泳 电导检测 苯丙氨酸 配体交换 1前言 氨基酸是组成生物大分子的基本单元，在生命起源、发育、病变及衰老等生命过程中都扮演着重要的角色，是蛋白组学研究的重要内容之一[1]。苯丙氨酸(Phe)是一种重要的氨基酸，是人和动物8种必需氨基酸的其中之一，其结构如图Ⅰ所示。苯丙氨酸[2]主要用作试剂及医药上的胃肠外营养输液，亦见用作特殊人员合成膳食、必需氨基酸片等营养强化剂的成分；苯丙氨酸还可作为昆虫人工饲料的成分；苯丙氨酸对治疗苹果疱茄病亦有效。L-苯丙氨酸是人和动物所需要的一种氨基酸，而D-苯丙氨酸是生产艾滋病病毒抑制剂的重要中间体[3]。 配体交换法是氨基酸手性分离的常用方法，基于配体交换原理的分离方式有气相色谱手性固定相法、液相色谱法、薄层色谱法、膜分离法、毛细管电泳法[4]等。目前已经报道的苯丙氨酸对映体的拆分方法，主要有高效液相色谱[5]、手性膜法[6]、薄层色谱[7]、离子色谱法[8]和毛细管电泳[9]等。氨基酸由于其结构简单，分离难度较大，且没有紫外或荧光吸收，通常需要柱前、在柱或柱后衍生才可得到检测。电导检测法具有通用性，氨基酸无须经过衍生即可检测，操作大大简化，是氨基酸一种理想的检测方法。 本实验以铜-L-赖氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC）构成二元手性选择体系，用毛细管区带电泳－电导法成功对未衍生的苯丙氨酸对映体进行分离，方法高效简便、分析成本低可发展于实际样品的分析应用。2 实验部分 2.1 仪器与试剂CES2003毛细管电泳仪（高压电源、电导检测器、毛细管电泳数据工作站，中山大学化学与化学工程学院研制）；pHS-3C精密酸度计（上海伟业仪器厂）；石英毛细管柱50 cm×50 μm（河北永年光导纤维厂），CQ-2B型超声波清洗器（明珠电器有限公司）。 图Ⅰ 苯丙氨酸的结构式(Phe, pI = 5.48) Fig.ⅠThe structure of Phenylalanine and Lysin (Phe, pI = 5.48) 氢氧化钠（NaOH，广州化学试剂厂，分析纯）、柠檬酸(Cit，天津市大茂化学试剂厂，分析纯)、乙酸铜（Cu(CH3COO)2·H2O，天津市科密欧化学试剂开发中心，分析纯），羟丙基甲基纤维素（HPMC，山东赫达股份有限公司，分析纯），D,L-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸（D,L-Phe、L-Phe，上海科学院生物化学研究所，层析纯），L-赖氨酸（L-Lys，上海伯奥生物科技有限公司产品，层析纯）。所用水为超纯水。 2.2 溶液的配制 分别配制0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L Cit、25 mmol/L Cu(Ac)2、25 mmol/L L-Lys和100 mg/L HPMC储备液。实验时，各取适量以制得不同浓度的电泳运行液。D,L-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸配制成1 mg/mL的储备液，进样时用缓冲液稀释到所需的浓度。 2.3 实验方法 毛细管柱在使用前依次用去离子水、0.1 mol/L HCl溶液、去离子水、0.1 mol/L NaOH溶液、去离子水和运行缓冲液分别冲洗约5 min，检测电极用超声波清洗，电极及检测池的制作参见文献[10]。采用电动进样方式，进样时间为8 s，进样电压为9.0 kV，分离电压为＋15 kV。实验在室温（25℃）、相对湿度75%的实验条件下进行。 3 结果与讨论 3.1手性选择体系的选择 实验仅采用铜离子作手性选择剂，苯丙氨酸对映体未能达到分离，结果见图Ⅱ.a；在铜离子存在的运行液中，加入L-赖氨酸，以Cu-L-Lys作配体络合手性选择剂，苯丙氨酸对映体不能达到基线分离，见图Ⅱ.b；实验中发现，在上述体系中添加羟丙基甲基纤维素（HPMC），苯丙氨酸对映体的分离度得到改善，如图Ⅱ.c所示。因此采用Cu(II)-L-Lys-HPMC的运行体系，本文认为