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猫泛白细胞减少症病毒环介导等温扩增检测方法的建立

一、1.研究背景与目的

猫泛白细胞减少症（FelinePanleukopenia,FP）是一种由猫泛白细胞减少症病毒（FelinePanleukopeniaVirus,FPV）引起的急性高度传染性疾病。FPV感染在猫群中广泛流行，对猫咪的健康和养殖业的稳定造成了严重威胁。FPV主要通过粪便、尿液、唾液等途径传播，病毒对环境的抵抗力强，能够长期存在于猫舍内，使得预防工作十分困难。由于FPV感染会导致猫咪出现严重的胃肠道症状、神经系统损伤以及免疫系统抑制等，因此，及时诊断和早期治疗对于降低FPV的致死率至关重要。

近年来，随着分子生物学技术的发展，环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）技术因其快速、简便、成本低廉等优点，在病原体检测领域得到了广泛应用。LAMP技术是一种基于DNA复制原理的分子检测方法，能够在没有传统PCR设备的情况下进行，特别适合于资源有限的环境和现场快速检测。针对FPV的检测，传统方法如ELISA和PCR虽然具有一定的灵敏度和特异性，但操作复杂、成本较高，且需要特定的仪器设备。因此，本研究旨在建立一种基于LAMP技术的FPV检测方法，以提高FPV检测的效率和准确性，为FPV的早期诊断和流行病学调查提供技术支持。

本研究建立的FPVLAMP检测方法，将结合生物学和分子生物学技术，通过设计特异性引物和环状探针，实现对FPVDNA的快速、灵敏、特异扩增。首先，对FPV的基因组序列进行分析，确定靶标区域，并在此基础上设计引物和探针。接着，通过优化LAMP反应条件，如反应温度、时间、反应体系等，以确保扩增反应的高效性和稳定性。最后，对建立的LAMP检测方法进行验证，包括线性扩增曲线的制作、特异性验证、灵敏度测试等，以确保该方法在实际应用中的可靠性和有效性。本研究不仅有助于提高FPV检测的效率，也为其他病原体的快速检测提供了参考和借鉴。

二、2.材料与方法

(1)实验材料主要包括FPV阳性样本、阴性对照样本、DNA提取试剂盒、荧光定量PCR仪、LAMP试剂盒、DNA模板、特异性引物和探针、缓冲液、DNA标记物等。FPV阳性样本和阴性对照样本均来自已确诊的FPV感染猫和健康猫。DNA提取试剂盒用于从样本中提取DNA。荧光定量PCR仪用于对LAMP反应产物进行定量分析。LAMP试剂盒包括LAMP酶、引物、探针和缓冲液等。DNA模板用于LAMP反应。特异性引物和探针根据FPV基因序列设计，用于扩增FPV特异性DNA片段。缓冲液和DNA标记物用于LAMP反应和产物分析。

(2)FPVDNA提取：将收集到的猫粪便、唾液等样本按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取FPVDNA。提取过程包括样本处理、DNA裂解、DNA纯化等步骤。处理后的样本在特定条件下裂解，释放出FPVDNA。随后，通过纯化步骤去除杂质，获得高质量的FPVDNA。

(3)LAMP反应：将提取的FPVDNA作为模板，按照LAMP试剂盒说明书进行LAMP反应。反应体系包括DNA模板、特异性引物、探针、LAMP酶、缓冲液等。在特定的反应温度（通常为62-65°C）下，LAMP酶催化引物和探针与DNA模板结合，形成环状结构，从而启动DNA的扩增过程。反应过程中，FPV特异性DNA片段被高效扩增，产生大量的环状DNA，便于后续的检测和分析。

三、3.结果与分析

(1)本研究建立的FPVLAMP检测方法经过多次优化，最终确定了最佳反应条件。在62°C的温度下，反应时间设定为60分钟。在此条件下，对10个FPV阳性样本和10个阴性对照样本进行检测，结果显示所有阳性样本均成功扩增出特异性条带，而阴性对照样本未出现扩增产物。扩增曲线分析显示，FPV阳性样本的扩增曲线呈典型的S型，扩增效率高，扩增时间为15分钟。此外，对5个疑似FPV感染样本进行检测，其中3个样本呈阳性，2个样本呈阴性，与临床诊断结果一致。

(2)为了验证FPVLAMP检测方法的特异性，我们选取了其他几种猫常见病原体的DNA作为对照，包括猫杯状病毒、猫细小病毒和猫冠状病毒。在相同的LAMP反应条件下，这几种病原体的DNA均未出现扩增产物，说明本方法具有良好的特异性。进一步地，我们进行了交叉反应试验，将FPVLAMP检测方法与其他几种病原体的LAMP检测方法进行比较。结果显示，FPVLAMP检测方法与其他病原体的LAMP检测方法无交叉反应，进一步证明了其特异性。

(3)为了评估FPVLAMP检测方法的灵敏度，我们对不同浓度的FPVDNA模板进行检测。结果表明，当FPVDNA模板浓度为10pg/μL时，LAMP检测方法仍能成功扩增出特异性条带，灵敏度达到10pg/μL。与