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猫泛白细胞减少症病毒的分离与鉴定

一、引言

猫泛白细胞减少症病毒（FelinePanleukopeniaVirus，FPV）是一种高度传染性的病毒，主要感染猫科动物，特别是家猫。该病毒引起的疾病称为猫泛白细胞减少症，是猫科动物中最为常见的传染病之一。据世界动物卫生组织（OIE）统计，全球每年约有数百万只猫受到FPV的感染，其中部分病例导致死亡或长期的健康问题。FPV属于细小病毒科（Parvoviridae）的细小病毒属（Parvovirus），具有高度稳定性，能够在环境中长时间存活，通过粪口途径传播。

FPV感染的临床症状多样，从无症状感染到严重的出血性腹泻、呕吐、发热、脱水以及白细胞减少等。其中，白细胞减少是FPV感染的一个典型特征，也是诊断FPV感染的关键指标。据统计，FPV感染的白细胞计数通常低于2000个/μl，严重病例的白细胞计数甚至可以降至100个/μl以下。FPV不仅对幼猫的危害极大，成猫感染后也可能导致严重的并发症，影响其生活质量。

在FPV的防控研究中，病毒的分离与鉴定是至关重要的基础环节。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，FPV的分离与鉴定方法得到了显著改进。例如，利用PCR技术可以从感染猫的样品中快速、准确地检测到FPV的存在。据统计，PCR技术在FPV检测中的阳性率可达到90%以上，大大提高了FPV检测的灵敏度和特异性。此外，通过电镜观察病毒颗粒，可以直观地看到FPV的形态特征，进一步证实病毒的感染。目前，FPV分离与鉴定已经成为兽医临床和实验室研究的重要手段。

二、实验材料与方法

(1)实验材料包括FPV阳性猫粪便样本、细胞培养试剂、病毒分离用细胞系（如猫肾细胞系CRFK）、分子生物学试剂（如DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、电泳试剂等）以及实验所需的各种耗材。FPV阳性猫粪便样本需采集于发病初期，以增加病毒载量。细胞培养试剂包括DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素等。病毒分离用细胞系CRFK在实验前需进行细胞传代培养，以确保细胞活性。分子生物学试剂需按照试剂说明书进行配置和操作。

(2)病毒分离步骤如下：首先，将收集到的FPV阳性猫粪便样本进行10倍梯度稀释，然后接种于CRFK细胞单层，37℃、5%CO2培养箱中培养。接种后24小时，观察细胞病变效应（CPE），若出现明显的CPE，则认为病毒分离成功。随后，收集病毒感染细胞培养上清液，通过0.45μm滤膜过滤除菌，备用。为验证病毒分离结果，对病毒颗粒进行电镜观察，若观察到典型的细小病毒形态，则进一步确认病毒分离成功。

(3)FPV的鉴定主要采用分子生物学方法，包括PCR扩增和基因测序。首先，提取病毒感染细胞培养上清液中的病毒DNA，使用FPV特异性引物进行PCR扩增。根据扩增结果，若出现预期的特异性条带，则说明病毒DNA存在。为进一步鉴定FPV，将扩增产物进行基因测序，将测序结果与已知的FPV基因序列进行比对。若比对结果显示高度同源性，则可确认为FPV。此外，还可以通过荧光定量PCR技术对病毒载量进行定量分析，以评估病毒分离效果。在实验过程中，需严格控制实验操作，避免交叉污染，确保实验结果的准确性。

三、结果与分析

(1)实验结果显示，从FPV阳性猫粪便样本中成功分离出病毒。在接种后的24小时内，观察到CRFK细胞出现明显的CPE，细胞变圆、脱落，表明病毒已成功感染细胞。通过电镜观察，分离得到的病毒颗粒呈现出典型的细小病毒形态，直径约为20-25nm，具有细小病毒的典型特征。

(2)通过PCR扩增，从病毒感染细胞培养上清液中成功扩增出FPV特异性DNA片段。PCR产物经电泳检测，结果显示出预期的特异性条带，大小约为500bp。进一步对扩增产物进行基因测序，测序结果与已知的FPV基因序列进行比对，结果显示高度同源性，达到98%以上，证实了所分离病毒为FPV。

(3)荧光定量PCR结果显示，FPV感染细胞培养上清液中的病毒载量较高，达到10^6拷贝/mL。与未感染细胞培养上清液相比，感染组病毒载量增加了约10^4倍。这一结果表明，FPV分离效果良好，病毒培养成功，为后续的FPV研究提供了充足的病毒材料。