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用于检测猫泛白细胞减少症病毒的RPA-FLD方法

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用于检测猫泛白细胞减少症病毒的RPA-FLD方法

摘要：猫泛白细胞减少症病毒（FelinePanleukopeniaVirus,FPV）是一种高度传染性疾病，对猫群的健康造成严重威胁。为了快速、准确地检测FPV，本研究开发了一种基于重组蛋白吸附亲和层析（RPA）和荧光原位杂交（FLD）的方法。该方法首先利用RPA技术特异性地结合FPV的核衣壳蛋白，然后通过FLD技术进行可视化检测。本文详细介绍了RPA-FLD方法的原理、操作步骤、特异性和灵敏度，并通过实验验证了该方法的可靠性。结果表明，RPA-FLD方法具有快速、灵敏、特异等优点，为FPV的检测提供了新的技术手段。

FPV是一种引起猫泛白细胞减少症的病毒，对猫群的健康和繁育产生严重影响。目前，FPV的检测方法主要包括病毒分离、酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）等。然而，这些方法存在操作复杂、耗时较长、灵敏度低等缺点。随着分子生物学技术的不断发展，基于RPA和FLD的检测方法因其快速、灵敏、特异等优点逐渐受到关注。本研究旨在开发一种基于RPA和FLD的FPV检测方法，以提高FPV检测的效率和准确性。

一、1.RPA-FLD方法原理及材料

1.1RPA技术原理

(1)重组蛋白吸附亲和层析（RPA）技术是一种基于蛋白质之间相互作用的新型分子诊断技术。其核心原理是利用两种特定蛋白质之间的互补结合特性，通过设计合成具有互补序列的核酸探针，实现目标蛋白质的特异性识别和结合。在RPA技术中，核酸探针与目标蛋白的结合强度远高于传统蛋白质结合方法，如ELISA等，这使得RPA技术在灵敏度上具有显著优势。例如，在检测FPV时，RPA技术可以实现对病毒核衣壳蛋白的高灵敏度检测，其灵敏度可以达到10^-12量级。

(2)RPA技术的工作流程主要包括探针设计、RPA反应和检测三个步骤。首先，根据目标蛋白的氨基酸序列，设计合成一段与目标蛋白具有高度互补性的核酸探针。接着，将探针与目标蛋白混合，在特定的温度和pH条件下，探针与目标蛋白发生特异性结合，形成稳定的RPA复合物。最后，通过检测RPA复合物的形成，实现对目标蛋白的定量分析。以FPV检测为例，RPA技术可以快速检测到病毒颗粒中的核衣壳蛋白，其检测时间仅需30分钟，大大缩短了传统检测方法的时间。

(3)RPA技术的应用范围广泛，尤其在病毒、细菌等微生物的检测领域具有显著优势。例如，在HIV、流感病毒等病原体的检测中，RPA技术展现了极高的灵敏度和特异性。在FPV检测方面，RPA技术已经成功应用于实际病例的检测，有效提高了FPV的早期诊断率。此外，RPA技术还与其他分子生物学技术如PCR、测序等相结合，实现了对病原体的快速、准确检测。研究表明，RPA技术在微生物检测领域的应用前景广阔，有望成为未来病原体检测的重要手段之一。

1.2FLD技术原理

(1)荧光原位杂交（FLD）技术是一种基于核酸序列互补配对原理的分子生物学检测方法。该技术通过将荧光标记的核酸探针与待测样本中的目标DNA或RNA进行杂交，利用荧光信号的变化来检测目标核酸的存在。FLD技术在病原体检测、基因表达分析等领域有着广泛的应用。例如，在FPV的检测中，FLD技术可以实现对病毒基因组的快速检测，其检测限可达到皮摩尔级别。

(2)FLD技术的基本流程包括探针设计、杂交、洗涤和信号检测。探针设计是FLD技术的关键步骤，需要根据目标基因的序列合成特异性探针。杂交过程中，探针与样本中的目标DNA或RNA形成双链结构，随后通过洗涤去除未结合的探针和非特异性杂交。最后，通过荧光显微镜或流式细胞仪等设备检测杂交后的荧光信号，从而实现对目标核酸的定量分析。以FPV检测为例，通过FLD技术，可以检测到病毒基因组中的特定序列，从而实现对FPV的快速、准确诊断。

(3)FLD技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。在FPV检测的实际应用中，FLD技术已经成功应用于病毒感染猫的样本检测，检测时间仅需数小时。与传统的病毒培养和PCR检测方法相比，FLD技术在检测速度和准确性上具有显著优势。此外，FLD技术还可以与其他分子生物学技术如RPA、测序等相结合，实现对病原体的多参数分析。随着FLD技术的不断发展，其在病原体检测和基因表达分析等领域的应用前景将更加广阔。

1.3实验材料

(1)在RPA-FLD方法中，实验材料的选择和质量直接影响到实验结果的准确性和可靠性。首先，需要准备FPV的核衣壳蛋白作为RPA反应的靶标。通常，FPV核衣壳蛋白可以通