流式细胞术步骤.docx

55 5 5 利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 1. 细胞按每孔 4×10 个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处 理细胞。 (设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组， 2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L 辛伐他汀组 正常对照组(NC 组)：胰岛素终浓度 0.058mg/L 组：辛伐他汀终浓度 2μmol/L+胰岛素终浓度 0.058mg/L； 组：辛伐他汀终浓度 5μmol/L+胰岛素终浓度 0.058mg/L； 组：辛伐他汀终浓度 10μmol/L+胰岛素终浓度 0.058mg/L； 于 37℃，5%CO2 培养箱中孵育 48h） 胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入 15ML 管中。 800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重 复两次，最后重悬细胞于 0.5mL PBS 中。 用低速振荡器边震动边加入 5 mL 预冷的 70%乙醇，固定，4℃过夜。 次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，弃上清，加入 4 mL PBS 清洗一 次，用 0.4 mL PBS 重悬细胞。 加入 5 μL RNaseA（10 mg/ml）37℃消化 1 小时，加入终浓度 50 mg/mL 碘化丙啶 （propidium iodide PI）4℃避光染色过夜（或者 37℃避光染色 1 小时），在 EPICS XL 流式细胞仪上分析。 利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 1. 细胞按每孔 4×10 个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处 理细胞。 2．胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入 15ML 管中。 800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于 0.1mL PBS 中，并转移到 1.5 mL 离心管中。 按照 1:100 加入 1UL 一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育 1-2 小时。 1500rpm，小型离心机离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心 弃上清，重复 3 次，最后将洗好的细胞重悬于 0.1mL PBS 中。 分别将荧光二抗 DyLight 488、DyLight 567 按照 1:100 比例加入细胞悬液中，室温孵育 1 小时。 1500rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 3 次，最后重悬细胞于 0.2mL PBS 中。 用锡箔纸包住避光，将细胞加入流式管中，在 EPICS XL 流式细胞仪上分析。 IR 检测 类型细胞 NC 组 NC 组 NC 组 A 组 B 组 C 组 一抗 无 IgG1 IR IR IR IR 二抗 无 DyLight 488 DyLight 488 DyLight 488 DyLight 488 DyLight 488 目的 空白对照 同型对照 实验组对照 实验组 1 实验组 2 实验组 3 GLUT4 检测 类型细胞 NC 组 NC 组 NC 组 A 组 B 组 C 组 一抗 无 IgG2a GLUT4 GLUT4 GLUT4 GLUT4 二抗 无 DyLight 567 DyLight 567 DyLight 567 DyLight 567 DyLight 567 目的 空白对照 同型对照 实验组对照 实验组 1 实验组 2 实验组 3 （因为 IR 和 GLUT4 同样为鼠源抗体，并且分开进行检测，二抗颜色可进行调试。尽可能 选择效果好的同一种二抗。可能使用一绿一红，也可能使用两个同样颜色的二抗）