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流式细胞术FLOW CYTOMETRY 检验部：刘志祥 地点：体检中心大楼三楼 电话：8801152 62516 流式细胞仪 BD公司流式细胞仪 流式细胞术的基本概念 流式细胞术(Flow Cytometry ,简称FCM)是利用流式细胞仪对生物颗粒（细胞、微生物以及人工合成微球）的多种物理和生物学特性进行定量分析的技术，并能对特定细胞群体加以分选。 流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞仪的基本结构 液流系统 流动室 流路与光路交汇处 液流驱动系统 流式细胞仪的基本结构 流式细胞仪的基本结构 流式细胞仪的工作原理 免疫荧光标记的待测细胞在鞘液的包裹下逐个通过流动室，在激光激发下发出散射光和荧光，经过光收集系统采集数据处理系统分析后，以图像的形式将数据结果显示在屏幕上。 流式细胞仪与显微镜的区别 流式细胞术的特点 单个细胞分析，灵敏度高 速度快：10000个细胞/秒 可同时进行多参数分析 统计学意义：提供细胞群体均值和分布情况 细胞不被破坏，分选后可继续培养 可分选感兴趣的细胞 流式细胞仪的检测信号 流式细胞仪的检测信号 荧光信号 细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达量 流式细胞仪的检测信号 荧光信号 多色分析 选择不同的单抗及荧光染料同时测定一个细胞上的多个不同抗原 FITC 绿色 513nm FL1 PE 橙色 575nm FL2 PeCy5 红色 675nm FL4 荧光信号的转换放大 线性放大：输入与输出线性关系，适用于强度变化范围较小的信号 如DNA、RNA、总蛋白 对数放大：输入与输出对数关系，适用于强度变化范围较大且较复杂的信号 如细胞膜表面抗原 流式细胞仪数据显示 单参数直方图 ( Histogram ) 双参数数据显示 双参数散点图(Dot Plot) 双参数等高线图(Contour Plot) 双参数密度图 (Density) 假三维图（Pseudo 3D Plot） 三维图（3D Plot） 流式细胞仪数据分析 单参数直方图分析 设线性门 阴性区（H区） 阳性区（B区） 流式细胞仪数据分析 双参数散点图分析 设十字门 双阴性区（F3区） 单阳性区（F1区） 单阳性区（F4区） 双阳性区（F2区） 流式细胞仪数据分析 双参数密度图分析 流式细胞仪数据分析 假三维图分析 常用荧光染料 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内/外的细胞因子 激素结合位点、细胞受体 pH值 钙离子浓度 细胞膜电位、线粒体膜电位 流式细胞仪的科研应用 干细胞研究/树突状细胞研究 细胞周期和DNA倍体分析 细胞凋亡 免疫功能研究（淋巴细胞亚群分析、细胞因子） 细胞功能研究（细胞内PH值、细胞内钙离子流、细胞膜电位、线粒体膜电位） 肿瘤相关基因表达的研究(如P53) 抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究 细胞特异性抗原FCM检测 树突状细胞(DC)的表面标记 CD1a CD80 CD86 调节性T细胞(Treg)的表面标记 CD4 CD25 Foxp3（胞浆抗原） 间充质干细胞(MSC)的表面标记 CD29 CD44 CD105 间充质干细胞鉴定 间充质干细胞鉴定 间充质干细胞鉴定 细胞周期和DNA倍体分析 原理 在细胞周期各时相，DNA含量发生周期性变化，通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定，可分析细胞周期各时相相对的百分比及DNA倍体。 细胞周期和DNA倍体分析 细胞周期和DNA倍体分析 DNA分析的意义 DNA倍体分析： 肿瘤的辅助诊断和疗效评估 不同处理因素下DNA倍体的改变 细胞周期分析： 不同处理因素下细胞周期的改变（转染、加药） 反映了肿瘤的生长速度和侵袭性，判断临床治疗方法的疗效或用于探讨新药新方法的作用机理和疗效。 细胞凋亡分析——PI 细胞凋亡的主要表现 DNA含量下降： 凋亡细胞核酸内切酶活化，DNA降解，细胞DNA减少 ，经PI染色后，表现在G1/G0期峰前出现亚二倍体峰，称为凋亡峰。 细胞凋亡分析——ANNEXIN-V/PI 细胞凋亡的主要表现 细胞膜不对称性改变： 胞浆侧的磷脂酰丝氨酸基团外翻，与Annexin-V高亲和力特异性结合，而早期凋亡细胞但仍然保持膜的完整性，对PI拒染，因此Annexin V/PI检测可区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞 细胞凋亡分析——ANNEXIN-V/PI 流式样本 来