亚甲基四氢叶酸还原酶基因677CT检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）产品说明书.doc

亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）产品说明书 【产品名称】 通用名称：亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T检测试剂盒 （PCR-熔解曲线法） 英文名称：Testing Kit for 5,10-methylenetetrahydrofolate Reductase Gene 677C/T Polymorphism（PCR-Dissociation Curve Analysis） 【包装规格】44人份/盒。 【预期用途】 用于人基因组DNA中亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因677C/T单核苷酸多态性（SNP）基因型的定性检测，其检测结果仅代表对MTHFR基因677C/T SNP基因型的判定，对于诸如冠心病、脑卒中、动静脉栓塞等心、脑血管疾病的发生提供风险提示。 MTHFR是甲硫氨酸-叶酸代谢中的一个关键酶，它将体内的5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，成为体内叶酸的主要活性形式，影响正常的DNA代谢以及维持血浆同型半胱氨酸（Hcy）的正常水平。MTHFR基因突变可导致MTHFR酶活性下降，使血浆Hcy增高及DNA低甲基化，造成高同型半胱氨酸血症（Hhcy）及染色体异常【1】。 人类的MTHFR基因位于染色体1p36.3，整个编码区长1980bp，编码蛋白的分子量为74.6kDa，其氨基酸序列高度保守。 现发现MTHFR基因有多种突变类型，不同的突变类型对MTHFR的酶活性和热稳定性产生不同的影响，常见的突变位点主要有677C/T、1298 A /C。677 C/T突变使得编码的丙氨酸被缬氨酸替代，使得酶活性下降。 【检验原理】 本试剂盒采用聚合酶链式反应和熔解曲线分析的方法（PCR-Dissociation Curve Analysis），检测MTHFR基因677C/T SNP 基因型。以人基因组DNA样本为模板，聚合酶链式反应(PCR)扩增MTHFR基因片段，此后逐渐增加温度，随着反应中双链DNA变性，荧光染料回复到游离状态导致荧光信号降低，仪器对荧光信号进行同步采集，绘制出DNA分子的熔解曲线。DNA分子的熔解曲线与DNA分子的GC含量、GC分布、片段长度等理化性质有关，不同的样本的基因多态性由于碱基作用力的不同呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度（Tm值），以阳性对照品熔解曲线为基准，对受检样品的SNP基因型进行分析判定。 【主要组成成份】 1. 试剂盒组分： 编号 名称 组分 规 格 01R1 PCR 扩增反应液 0.001% dATP，dGTP，dCTP，dTTP ，Taq酶，Taq酶缓冲液，SYBRgreen，Mg2+，纯化水，二甲基硅油 1100μl×1管 01R2 PCR扩增引物 MTHFR677扩增正反向引物，TE缓冲液 50μl×1管 01R3 野生型阳性对照品 MTHFR 677CC线性正反向DNA，TE缓冲液 50μl×1管 01R4 杂合突变型阳性对照品 MTHFR 677CC线性正反向DNA，MTHFR 677TT线性正反向DNA，TE缓冲液 50μl×1管 01R5 纯合突变型阳性对照品 MTHFR 677TT线性正反向DNA，TE缓冲液 50μl×1管 01R6 阴性对照品 纯化水 50μl×1管 2. 本试剂盒未提供，用户自备试剂如下： 本品不含核酸提取组分，采用商业化基因组DNA提取试剂盒。 3. 阳性对照品为人工合成的线性DNA。 4. 不同批号的试剂盒组分不可混合使用。 【储存条件及有效期】 －20±2℃保存，有效期12个月。使用过程避免反复冻融，冻融次数建议不超过5次。试剂盒在37℃条件下放置建议不超过2天。试剂盒在37℃气温条件下干冰运输建议不超过3天。 【适用仪器】 适用于有熔解曲线检测功能的qPCR扩增仪，如上海宏石医疗SLAN-48P。 【样本要求】 1. 检测样本类型：人基因组DNA； 2. 10 ng/μl≤DNA浓度≤100 ng/μl； 3. DNA的OD260/OD280值在1.6～2.0之间； 4. DNA样本于－20±2℃保存，保存时间不超过6个月； 5. DNA样本避免反复冻融，冻融次数不超过3次。 【检验方法】 1. 样本处理（样本制备区） 人类基因组DNA的提取采用商业化的DNA提取试剂盒， 建议使用天根生化科技（北京）有限公司生产的“血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒”（离心柱型）（货号：DP304-03，规格：50/200人份）与“红细胞裂解液”（货号：RT122，规格：100ml/盒、250ml/盒）。 2. 加样（样本制备区） 2.1 将18.5μl/份PCR扩增反应液和0.5μl/份PCR扩增引物按比例混合，并短暂离心，将混合液按19.0μl/管分装至0.2ml PCR反应管中。 2.2