人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书.doc

人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒 英文名称：? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR 【包装规格】 /盒 【预期用途】 EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路， PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的过度表达。 EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子研究表明。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。 本试剂盒以DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。 【检测原理】 本试剂盒结合特异性引物和Taqan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过Taqan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。 【主要组成成分】 本试剂盒具体包含组分如表1 表1 组分 份数 体积(μL) 19-Del（1）检测反应液 1 10 2 19-Del（2）检测反应液 1 10 3 S768I检测反应液 1 10 4 20-Ins检测反应液 1 10 5 T790M检测反应液 1 10 6 L858R检测反应液 1 10 7 L861Q检测反应液 1 10 8 G719X检测反应液 1 150 外控检测反应液 1 150 r-Taq酶 1 阳性对照DNA 1 10 无菌超纯水 1 500 【储存条件及有效期】 避光，-20℃以下保存，避免反复冻融(不要超过5次)，有效期6个月。 【适用仪器】 ABI 7300，ABI 7500，ABI 7900，ABI StepOne，ABI StepOne Plus，Rotor-Gene Q 【样本要求】 本试剂盒可以检测从新鲜组织及FFPE组织中提取的DNA，DNA质量及浓度影响检测的特异性和灵敏度。DNA的质量与样本保存时间样本组成DNA提取方法密切相关；而且所采集的临床样本中正常组织细胞的混杂程度也不同，因此对样本做如下要求： 新鲜标本的制备过程中，术后标本取下后应立即放入-20℃以下冰箱中保存；石蜡包埋组织制备过程中，术后标本应在1 个小时内放入10％中性缓冲福尔马林溶液中固定，用量应为组织块的4-20 倍，固定时间应在6-48 小时之间； 2、 新鲜组织样本，要确保含有肿瘤细胞大于1%，尽量减少正常组织、间质及坏死组织，推荐使用商业化 试剂盒提取DNA(AXYGEN，QIAGEN等公司产品)。提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于-20℃保存。 3、 FFPE组织样本，要确保含有肿瘤细胞，尽量去除坏死组织及石蜡边缘，推荐使用商业化试剂盒提取DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)。提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于-20℃保存。FFPE组织样本保存年限尚未超过3年。 4、 样本切片规格要求为：横切面面积至少6mm×6mm，厚度10μm，3片，如果切片面积小请适当增加切片数。最终提取的DNA用