免疫检测技术.ppt

常见标记免疫技术放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术四、免疫标记技术第30页,共53页，2024年2月25日，星期天该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的灵敏度（pg）和自动化检测等特点，因此在实验研究和临床检测中仍被广泛应用。主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等小分子化合物的定量分析。1.放射免疫技术（125I）第31页,共53页，2024年2月25日，星期天放射免疫分析－基本原理竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力第32页,共53页，2024年2月25日，星期天Ag*AbAg标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性放射免疫测定法(RIA)示意图第33页,共53页，2024年2月25日，星期天RIA法原理及标准曲线7550301001101001000未标记抗原浓度（ng/mL)结合/未结合的放射活性（%）Ag*-AbAg*第34页,共53页，2024年2月25日，星期天将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体，制成荧光抗体诊断试剂。用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断抗原的存在、定位和分布情况。免疫荧光技术有直接法和间接法等。2.免疫荧光技术第35页,共53页，2024年2月25日，星期天免疫荧光技术——直接法Ag荧光素标记的特异性抗体组织切片第36页,共53页，2024年2月25日，星期天免疫荧光技术——间接法Ag荧光素标记的抗抗体组织切片待测抗体第37页,共53页，2024年2月25日，星期天免疫荧光染色显示细胞骨架免疫荧光染色是利用抗原－抗体特异性结合的原理，用经荧光染料标记的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种显示绿色荧光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488显示红色荧光：RhodamineB,TexasRed,Alexa-546,568,594显示蓝色荧光：Alexa－350用Alexa488标记的抗人α-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,DAPI染色人皮肤角化细胞免疫荧光染色用抗α-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,DAPI染色(激光共聚焦显微镜照片)PtK1细胞免疫荧光染色第38页,共53页，2024年2月25日，星期天本法是抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化活性相结合的免疫检测技术。酶标记的抗原或抗体与待检标本中的相应成分特异性结合，根据酶作用底物后的颜色变化，采用肉眼或酶标检测仪分析、判断结果。常用方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者用于检测可溶性抗原或抗体，后者常用于检测组织中或细胞表面的抗原。3.免疫酶测定法第39页,共53页，2024年2月25日，星期天是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行的抗原抗体反应。实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），底物为二苯基联苯胺。酶联免疫吸附试验（ELISA）：第40页,共53页，2024年2月25日，星期天ELISA试验三个必要的试剂(1)固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）(2)酶标记的抗原或抗体（标记物）(3)酶作用的底物（显色剂）第41页,共53页，2024年2月25日，星期天底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234基本步骤第42页,共53页，2024年2月25日，星期天五种常见的检测方法1双抗夹心法（测定抗原）2测定抗体的间接法3竞争法（测定抗原）4捕获包被法测IgM抗体5ABS-ELISA法第43页,共53页，2024年2月25日，星期天适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及低于二价的小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心1