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土壤脲酶测定（专用）关松荫 苯酚-次氯酸钠比色法测定土壤脲酶活性 （Sunny-zhao） 1 方法原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物内。它是一种酰胺酶作用是极为专 性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨、二氧化碳和水。土壤脲酶活性与 土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶 活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤，所以人们常用土壤脲酶活性表征土 壤氮素的状况。 土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可 以通过测定为水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨在强 碱性介质与苯酚——次氯酸钠的作用生成蓝色的靛酚，其颜色深浅与溶液中的 NH4+-N 含量成正比，进而分析脲酶活性。 2 试剂和材料 2.1 甲苯分析纯。 2.2 10% 尿素：称取10 g 尿素，用水溶至100 ml。 2.3 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.7 ）：184 g 柠檬酸和147.5 g 氢氧化钾溶于适量蒸馏 水中，用水稀释至950 ml，用1 mol/L NaOH 将pH 调至6.7，最后用水定容到1000 ml。 2.4 苯酚钠溶液 （1.35 mol/L）：62.5 g 苯酚溶于少量无水乙醇，加2 ml 甲醇和 18.5 ml 丙酮，用无水乙醇稀释至100 ml （A 溶液），存于冰箱；27 g NaOH 溶于 100 ml 水（B 液）。将A、B 保存于冰箱中。使用前将A、B 液各20 ml 混合， 用蒸馏水稀释至100 ml。 2.5 次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为 0.9%。（根据分析纯原 有活性氯含量而定） 2.6 氮的标准溶液：精确称取0.4717 g 硫酸铵溶于水并稀释至1000 ml，得到1 ml 含有0.1 mg 的氮的标准液。 3 主要仪器 恒温培养箱，可见分光光度计。 4 分析步骤 4.1 标准曲线的测定 将标准溶液稀释10倍（吸取10 ml标准液定容至100 ml）制成氮的工作液（0.01 mg/ml ）。从其中分别吸收0 ，1.00，3.00，5.00，7.00 ，9.00，11.00，13.00 ml 移 至50 ml 容量瓶，加水至20 ml，再加入4 ml 苯酚钠溶液，充分混合。紧接着加 入3 ml 次氯酸钠，随加随摇匀，放置20 min 后显色，用水稀释至刻度。1 h 内将 显色液在可见分光光度计上于578 nm 处，以1 cm 比色皿进行比色测定，以试剂 空白为参比。然后以氮工作浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 称取5 g 新鲜土样于50 ml 容量瓶中，加1 ml 甲苯，轻轻摇匀，15 min 后加 10 ml 10%尿素溶液和20 ml 柠檬酸缓冲液（pH6.7 ），并摇匀。将锥形瓶放入37℃ 恒温箱中，培养24 h。培养结束后，用热至38℃水稀释至刻度，充分摇荡，并将 悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。 过滤后取3ml 滤液加入50 ml 容量瓶中，加蒸馏水至 10 ml，充分震荡。再 加入4 ml 苯酚钠溶液，充分混合。紧接（立即）着加入3 ml 次氯酸钠，充分摇 荡，放置20 min ，用蒸馏水定容到刻度。溶液呈靛酚的蓝色（在1 h 内保持稳定）。 1 h 内将显色液在分光光度计上于578 nm 波长处进行比色。 注意事项： 设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当 于其他实验中所做的空白对照。 无土对照：不加土样，其他与试验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。 有土无基质对照：以等体积的蒸馏水代替基质（10%尿素），其他操作与样 品试验相同，以排除土样原有的氨对实验结果的影响。 如果样品吸光度值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养土 样。 5 计算结果 以24 小时后1 g 土壤中NH -N 的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure ）。 3 Ure （mg NH4+-N—N/ g /24 h (d) ）= （a 样品-a 无土-a 无基质）*V*n/m (mg/g/24h) 式中：a 样品为样品吸光值由标准曲线求得NH -N 毫克数。