质粒DNA分离纯化技术.PDF

美好明日 美好未来 质粒 DNA 分离纯化技术 ? 质粒相关理论知识 质粒是染色体外的 DNA 分子，其大小范围在 1kb 至 200kb 以上不等，以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，大多数质粒的宿主范围较窄，复制和转录或多或少依赖于宿主 编码的酶和蛋白质。质粒携带的一些基因赋予宿主某些特殊的表型，其中不少具有重要的医学和商业价值。 由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性，产生抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制性酶与修饰性酶，以及降 解复杂的有机化合物等。 在基因工程中质粒常被用做基因的载体，质粒提取也就成为分子生物学实验室一项最基本的工作。下 面简要介绍一下质粒 DNA 分离纯化的原理和技术，以及一些小窍门。 ? 分离纯化原理和技术 从细菌中提纯质粒的方法很多，无一例外都包括以下三个步骤：培养细菌；收集和裂解细菌；纯化质粒 DNA。质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点，已经成功应用 了 20 余年。 碱裂解法涉及三种主要溶液，分别是：溶液 I，50mM 葡萄糖/25mM Tris-Cl/10mM EDTA,pH8.0；溶 液 II， 0.2N NaOH/1%SDS；溶液 III，3M 醋酸钾/2M 醋酸。溶液 I 用于重悬菌体，EDTA 是一种二价金属离子的鳌 合剂，能够抑制 DNase 的活性。溶液 II 起裂解细胞的作用，NaOH 是强碱，SDS 是一种弱碱性的去污剂， 容易与蛋白质结合，临用前用新鲜的 0.4N NaOH 和 2%的 SDS 等体积混合。长时间的碱性条件会打断 DNA， 基因组 DNA 一旦断裂成 50-100kb 大小的片段就不会被沉淀下来，最后导致抽提的质粒 DNA 不纯，所以加 入酸性的溶液 III 用于中和碱，中和之后绝大部分的蛋白质和基因组 DNA 沉淀下来。接着用酚/氯仿/异戊醇 抽提除去残留的少量蛋白，然后醇沉淀质粒 DNA。经过上面的处理，沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切 了。如果要用于更高级的实验，如转染，则需要做进一步的纯化，如 PEG 分级沉淀或 CsCl 超离心。 当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性，不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法， 质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了。所以，要降低不可逆的变性，就要控制 好碱裂解的时间。碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。文献推 荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低， 如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着碱裂解时 间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的 使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。很多抽提大质粒 的试剂盒用的就是碱裂解法。 目前有很多商品化的质粒纯化试剂盒，大大方便了质粒 DNA 的提取纯化。绝大部分试剂盒都是基于传 统的碱裂解法，结合利用能够特异性吸附 DNA 的固相介质和洗脱质粒 DNA 的特殊缓冲溶液。有多种不同 的基质，比如玻璃、硅藻土等，最常用的是阴离子树脂如 DEAE（二乙胺乙基）或