R9蛋白转导肽串联的苦荞金属硫蛋白突变体的制备及活性研究.pdf
中文摘要
苦荞属蓼科(Polygonaceae)是双子叶植物,含有丰富的营养物质,具有抗氧化、
降血脂等十分突出的保健功能。苦荞发挥特定生物学功能与其蛋白质密切相关。其中
苦荞金属硫蛋白(FagopyrumtataricumMetallothionein,FtMT)是一类低分子量蛋白
质,因其富含半胱氨酸(Cys-),在机体重金属解毒和降低氧化应激方面均具有重要
的生理功能。本课题组前期采用基因工程技术将蛋白转导肽R9与FtMT融合表达,
获得可以高效穿膜进入细胞的重组蛋白R9-FtMT2。本研究旨在采用基因定点突变技
术,改变R9-FtMT2的一级结构,增加其功能氨基酸Cys-和功能基序的数量,获得
抗氧化活性更高的R9-FtMT2突变体。具体研究内容为:首先对四种突变体的结构与
稳定性用生物信息学软件预测与分析;然后通过PCR定点突变技术构建原核表达载
体,优化四个突变体的蛋白表达条件并进行分离纯化;进一步筛选出抗氧化功能较强
的突变体R9-FtMT2-3进行牛乳保鲜实验;最后利用带有荧光标签的重组蛋白R9-
FtMT2-GFP进行细胞穿膜及细胞活性实验,采用基因定点突变方法构建载体,纯化
R9-FtMT2-GFP-3后观察重组蛋白穿膜功能,并且检测其对细胞的毒性及对细胞氧化
损伤的修复作用。
实验结果如下:
(1)R9-FtMT2四个突变体的生物信息学分析及表达载体的构建
通过生物信息学在线分析工具得出:R9-FtMT2四个突变体与未突变蛋白相比均
为较稳定蛋白,均为亲水性蛋白且具有跨膜功能,二级结构稳定性均没有太大改变,
但三级结构尚不确定,还需后续的研究。通过琼脂糖电泳检测与测序结果表明:表达
载体pET28a-SUMO-R9-FtMT2-1、pET28a-SUMO-R9-FtMT2-2、pET28a-SUMO-R9-
FtMT2-3和pET28a-SUMO-R9-FtMT2-4构建成功。
(2)改造蛋白R9-FtMT2-1、R9-FtMT2-2、R9-FtMT2-3和R9-FtMT2-4表达
纯化及抗氧化活性研究
通过SDS电泳显示R9-FtMT2-1的最佳表达条件为37℃、5h、IPTG浓
度为1.0mM,R9-FtMT2-2、R9-FtMT2-3和R9-FtMT2-4的最佳表达条件为37℃、7
h、IPTG浓度为1.0mM。通过亲和层析的方法在200mM咪唑缓冲液洗脱下成功
纯化得到了四种改造蛋白。
I
通过体外测定四种改造蛋白均具有清除超氧阴离子、羟自由基、DPPH自由
基的能力和总抗氧化能力,且R9-FtMT2-3的总体抗氧活性较好。
(3)融合GFP标签突变表达载体pET28a-R9-FtMT2-GFP-3的构建、改造蛋
白表达纯化、细胞活性研究及牛乳保鲜实验
改造蛋白R9-FtMT2-GFP-3表达载体构建成功,其最佳优化条件为:37℃、2h、
IPTG浓度为1.0mM;在500mM咪唑缓冲液洗脱下分离纯化了R9-FtMT2-GFP-
3。通过荧光显微镜观察R9-FtMT2-GFP-3仍具有穿膜功能,并没有受到突变的影响;
对HEK293T细胞毒性较小,蛋白浓度为120μg/mL时细胞存活率仍有80%以上;
R9-FtMT2-GFP-3对HEK293T细胞具有显著的抗氧化修复作用。最后通过牛乳保鲜
实验得出与未突变的蛋白相比R9-FtMT2-3的保鲜效果较好。
综上所述,本研究采用定点突变的分子改造技术制备了具有穿膜功能、细胞内可
视性良好并且抗氧化活性较强的重组蛋白R9-FtMT2-GFP-3,为FtMT在食品加工、
生物医药、化妆品等多个领域的进一步应用奠定基础。
关键词:苦荞;金属硫蛋白;定点突变;抗氧化活性;细胞活性
II
ABSTRACT
ThePolygonaceaefamilyhasadicotyledonousplantknownasTartarybuckwheat,
whichconta