p c D N A 3 1 N T G F P小 凹蛋白 1 及突变体表达.pdf

维普资讯 CN43．1262／R中国动脉硬化杂志2005年第 l3卷第 3期 297 [文章编号] 1007．3949[2005)13—03·0297—04 · 实验研究 · pcDNA3．1／NT—GFP小凹蛋 白1及突变体表达 载体的构建及功能分析 徐阳炎 。杨慧龄 ，涂 剑 ，何淑雅 ，廖端芳 (1．南华大学药物药理研究所，湖南省衡阳市421001；2．中南大学药学院，湖南省长沙市410078) [关键词] 分子生物学； 小凹蛋白1； 突变体；克隆； 聚合酶链反应 摘【 要】 目的 构建peDNA3．1INT—GFP小凹蛋白1及对突变体表达栽体及表达蛋白生物活性进行分析。方法 采用硫化修饰引物与Pfu酶结合的高度保真性聚合酶链反应体系，自行设计多对引物，分别扩增带His标签的小 凹蛋 白1全长 目的片段、小凹蛋白 1(缺失81～101位氨基酸)突变体 1片段及小凹蛋 白1(缺失 143～156住氨基酸) 突变体2片段 ：分剐亚克隆入PeDNA3．I／NT-GFP-TOPO真核表达栽体，转化TOP10E．ocli大肠杆茵，在含氨苄的固体 LB培养基上随机挑取 6个克隆，分别提取质粒后，用PcR法筛选含正确插入阅读框的阳性克隆子并测序鉴定。用 脂质体介导法瞬时转染入HepG2细胞，用MTr法、Westernblot法初步鉴定GFP-His小凹蛋 白1及突变体重组融合蛋 白的生物学活性。结果 筛选得到正确pcDNA3．．I／NT-GFP-His小凹蛋 白1及突变体表达我体，测序结果无碱基 突 变及阅读框移码．GFP-His小凹蛋 白1及突变体重组融合蛋 白具有天然表达蛋白相似的生物学活性。结论 成功 构建具有生物学活性的pcDNA3．I／NT-GFP小凹蛋白1及突变体表达栽体 ，为小凹蛋白1的功能研究奠定基础。 [中图分类号] Q7 [文献标识码] A Construction，Identification and PrimaryFunctionalAnalysisofpcDNA3．1／NT—GFP— Caveolin一1andMutantsPlasmids xuYang-YallI。YANGHui—Lin异I。11JJina -HEShu—Ya。andLIAODuan-Fang (1Instituteof mm珏∞如 and．P7r玎0|cy。NanhuaUniversity。Hengyang421001；2．D甲阱删 of 加l 蝴 。Schoo／ofPhannaceta／oa／ See／nce。＆r蛔 SouthUn／verstiy。 d 410078。Ch／na) [KEYWORDS] Caveolin-1；PolymemseChainReaction；Cloning；MutantsPIasmids 【ABs11ACr] Aim Toconstructandidentifiedtheeukaryoficexpressionrecombinantplasmidscontainingeaveolin-1gene andmutantsforhtepotentialfunctionalnaalysis． Methods Using anovelhighfidelitygeneexpressionprofilingstrategyreed· iatde byPfuproofreading polymerasescomb ining wiht phosphomthioatemodifide primers，PCR-amplifide ORFsofeaveolin-1and itsmutantswereinsertde