《生物化学技术6凝胶过滤11》课件.ppt

分离对象：溶解度、带电性等理化性质相似而分子质量不 同，或者是聚合度不等的混合物溶液 实例：Sephadex G-200层析纯化AFP 制备Ag-Ab复合物 溶于少量0.1mol/L Gly-HCl缓冲液中，并用本液透析2h 上Sephadex G-200柱 得AFP峰 置0.1mol/L柠檬酸-磷酸缓冲液（pH4.8）透析 上柱洗脱 AFP纯品 二、分离生命物质 热源物质：指微生物产生的分子量很大的某些多糖蛋白复 合物等，能使人体发热的物质 材料：Sephadex G-25（80~120目 ） 特点：比活性炭吸附、离子交换吸附等方便 实例：用Sephadex G-25凝胶层析除去氨基酸粗品中的热源质：利用热源（大分子蛋白类）的Kav=0，而氨基酸的Kav≈1，将试剂量控制在柱体积的20~30%，能实现完全分离 三、去热源物质 原理： Kav = －b lgM + c 或lgM = a－dKav (M为分子质量，常数a、b、c、d均大于0) 　先做标准曲线，再在相同条件下测样品 　Kav 也可用以下4个指标代替 ①Ve－Vo：分离体积 ②Ve/Vo：相对保留体积（另R＝ Vo/Ve） ③Ve/Vt：简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响较小 ④Ve：洗脱体积 特点：简便实用，所需样品量较少 四、测定分子质量 ①pH6~8的范围内，曲线线性才比较好；而在极端pH时，由于变性等原因易偏高 ②一般适用于球状pro的分子量测定，而纤维状pro不合适 ③糖蛋白中若糖的比例＞5％时，测定结果偏大 ④不受变性剂如尿素和盐酸胍的影响 ⑤有些酶类不适用。如淀粉酶，能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应 用凝胶过滤法测定分子量的局限性 若在Sephadex分子上连接DEAE、羧甲基或磺酸乙基等离子基团，可使凝胶在具有分子筛基础上，还具有离子交换能力，大大提高Sephadex在生化制药中的应用范围 如：DEAE-Sephadex A-25可用于制备无热原物质的去离子水 五、其 他 4．在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml，其外水体积和总体积分别为60ml和200ml，求分配系数是多少? 思考题 解： Ve= Vo+ Kav×（Vt－ Vo ） 　　　 140= 60 + Kav×（200－ 60） 　　　 Kav=0.57 　　解：最大理论加样量 Vp=Vs=Vt/2 　　 =3.14 ×(5.0/2)2× 60/2 =589ml 思考题 5．在5.0cm×60cm的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最 多加样体积是多少毫升? 谢谢使用！ 各组分间的 值差异越大，分离效果越好； 差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分 1、当Kav=0时，则Ve=Vo ，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分Ⅰ） 2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi 。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi （图中组分Ⅲ） 3、当0＜Kav＜1时，Ve=Vo+ Kav（Vi ＋ Vg ）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+Vi＋Vg之间变化（图中组分Ⅱ） 4、有时Kav＞1，表示凝胶对组分有吸附作用 （从内水中洗脱出来的含量下降），此时Ve＞Vo+Vi＋Vg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值 二、 值的测定 只要测出 、 和 ，即可计算出 值 的测定：（1）计算法： （2）测定法： 的测定：用蓝色的葡聚糖2000（M=200万），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（210、260或620nm）洗脱体积 的测定：用 、N-乙酰酪氨酸或其他小分子物质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是 （ =1） 当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则 介于